Summary
Nanodeeltjes van indinavir, ritonavir, efavirenz en atazanavir zijn vervaardigd met behulp van nat vermalen, homogenisering en ultrasone trillingen. Deze nanoformulations, gezamenlijk aangeduid als nanoformulated antiretrovirale therapie (NanoArt), beoordeeld macrofaag-based drug delivery. Monocyt-afgeleide macrofaag NanoArt opname, retentie en vertraagde afgifte werden bepaald. Deze voorbereidende studies suggereren de mogelijkheden van NanoArt voor klinisch gebruik.
Abstract
Nanoformulated drugs kunnen verbeteren farmacodynamiek en de biologische beschikbaarheid, terwijl die ook aan drugs toxiciteit te verminderen voor de antiretrovirale (ARV) medicijnen. Daartoe heeft ons laboratorium toegepast de principes van de nanogeneeskunde om ART regimes vereenvoudigen en als zodanig te verminderen toxiciteiten terwijl het verbeteren van de naleving en drugs farmacokinetiek. Eenvoudige en betrouwbare methoden voor de productie van nanoformulated ART (NanoArt) worden getoond. Deeltjes van pure drugs worden ingekapseld door een dunne laag van oppervlakte-actieve stof lipide coating en geproduceerd door fractionering van grotere kristallen drugs in kleinere door een nat malen of hoge druk homogenisatie. In een alternatieve methode vrij geneesmiddel wordt gesuspendeerd in een druppel van een polymeer. Hierin is het medicijn opgelost in een polymeer vervolgens geagiteerd door ultrasone trillingen totdat de individuele nanogrootte druppeltjes worden gevormd. Dynamische lichtverstrooiing en microscopisch onderzoek karakteriseren van de fysische eigenschappen van de deeltjes (deeltjesgrootte, lading en vorm). Hun biologische eigenschappen (cel-opname en retentie, cytotoxiciteit en antiretrovirale effectiviteit) worden bepaald met menselijke monocyt-afgeleide macrofagen (MDM). MDM afkomstig zijn van menselijke perifeer bloed monocyten geïsoleerd uit leukopacks gebruikmakend van centrifugaalkracht elutriatie voor zuivering. Dergelijke bloed overgedragen macrofagen kunnen worden gebruikt als cellulaire transporteurs voor NanoArt distributie naar het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) geïnfecteerde organen. We stellen dat de ompakking van klinisch beschikbare antiretrovirale medicijnen in nanodeeltjes voor HIV-1 behandelingen kunnen naleving te verbeteren en een positieve invloed ziekte resultaten.
Protocol
NanoArt productie
1. Natmalen NanoArt door Netzsch MicroCer Methods
- Weeg het geneesmiddel kristallen en verschillende oppervlakte-actieve stoffen die gebruikt zullen worden om de nanoformulations met behulp van een analytische balans te maken en meng ze met 10 mM Hepes buffer, pH 7,8 met behulp van een T-18 ultraturrax mixer tot het volledig verspreid. Het percentage van het geneesmiddel in de formulering moet tussen 1 - 2%.
- Voor continue frezen, zorg ervoor dat de koeler en de compressor is ingeschakeld. De uitlaatdruk moet ongeveer 100 PSI voordat u begint te frezen uw monster.
- Zet de controle-unit en draai de tank slijpen, zodat het slijpen media kunnen worden geladen in de tank.
- Voeg 50 ml van kralen aan de maalkamer met behulp van een trechter. Zorg ervoor dat er geen kralen in de draden of ergens buiten de maalkamer om lekken te vermijden in de mechanische afdichting.
- Zorg ervoor dat de O-ring is in zijn plaats op de maalkamer. Selecteer een geschikte scherm maaswijdte en gebruik de juiste deksel montage en zet de deksels door het aandraaien van de moeren. Het scherm met een maaswijdte moet ten minste de helft van de grootte van de korrels worden. Gebruik een groot scherm maaswijdte om het product te voorkomen van verstopping van de filter, terwijl continue frezen.
- Laat de maalkamer om het horizontaal met behulp van de knop die op de bovenkant van de kamer en zorg ervoor dat het product uitlaatbuis mondt uit in het verzamelen schip.
- Voeg de drug ophanging met verschillende hoeveelheden van oppervlakteactieve stoffen om het product inlaat. Het minimale volume van de suspensie moet 100 ml zijn. Dit voorkomt dat de maalkamer tegen oververhitting en ook kraal besmetting te voorkomen door minder slijtage van onderdelen
- Start de pomp met behulp van de controle-unit. Het debiet kan worden gevarieerd als nodig is voor uw formulering (~ 50 - 150 ml / min).
- Zet het roerwerk op en stel de snelheid op de controle-eenheid. De snelheid kan worden verhoogd van 620 rpm tot 4320 rpm op een MicroCer. Monitor de temperatuur met de temperatuurmeter, dat is op de top bevestigd aan de maalkamer en zorg ervoor dat er geen oververhitting.
- Molen het monster bij verschillende snelheden en debieten en neem kleine porties (~ 1 ml) van de formulering voor de grootte en lading metingen met behulp van een Diffractie Light Scattering Brookhaven Zetasizer (tabel 1).
- Nadat de gewenste grootte is verkregen, stop het frezen met behulp van de controle-unit. Met de pomp nog steeds op, het verzamelen van het monster in een kolf. Laat de drug volledig afwateren in de monstername kolf.
- Schakel de pomp. Voor het verwijderen van de kralen, plaats een opvangbak onder de unit. Draai de moeren op de frontplaat van het deksel montage en het verzamelen van de parels in de lade. Verwijder de frontplaat en gebruik een gedeïoniseerd water fles om de kralen te wassen in de lade.
- Breng de gemalen suspensie over in 50 ml centrifugebuizen en zet de centrifuge tot 10.000 rpm (10.174 RCF) gedurende 30 minuten. Na voltooiing van de centrifuge cyclus, het meten van de hoeveelheid supernatant en te vervangen door dezelfde hoeveelheid verse oppervlakteactieve oplossing.
- Zodra resuspensie is voltooid, de overdracht van de schorsing van de maalkamer en molen voor 10 minuten. Neem een hoeveelheid (~ 1 ml) en opnieuw meten van de grootte en lading van het monster met behulp van de Zetasizer (tabel 1).
- Voer een post-gebruik het schoonmaken van de MicroCer gebruik van gedemineraliseerd water en 70% ethanol.
- Meet de concentratie van de NanoArt formuleringen met behulp van HPLC. In ons geval hebben we de monsters door omgekeerde fase HPLC met behulp van drie exemplaren 20 uL injecties op een YMC Octyl C8 kolom (Waters Inc, Milford, MA) met een C8 guard cartridge. Mobiele fase bestaande uit 48% acetonitril / 52% 25mm KH 2 PO 4, pH-waarde 4,15 is gepompt op 0,4 ml / min met een UV / VIS-detectie bij 272 nm. Voor alle drugs metingen wordt kwantificatie bepaald door vergelijking met een standaard curve van elke vrije drug (0.025 tot 100 ug / ml) bereid in methanol.
2. NanoArt Homogenisatie het gebruik van de Avestin EmulsiFlex C5
- Meet de drug kristallen en verschillende oppervlakte-actieve stoffen die gebruikt zullen worden om de nanoformulations met behulp van een analytische balans te maken en meng ze met 10 mM Hepes buffer, pH 7,8 met behulp van een T-18 ultraturrax mixer te voltooien dispersie te verkrijgen.
- Breng de suspensie op de homogeniserende schip en beginnen met recirculatie. Zorg ervoor dat de koelmachine is op voordat u het monster homogeniseren
- Verhoog de druk geleidelijk aan tot de meter 20,000 ± 2,000 psi leest en blijven om te homogeniseren totdat de beoogde deeltjesgrootte is bereikt. Dit duurt meestal tussen de 45 - 60 minuten. Periodiek Neem een hoeveelheid (~ 1 ml) en meet de grootte en lading van het monster met behulp van een Zetasizer (tabel 1).
- Breng de gehomogeniseerd schorsing van de homogenisator tot 50 ml centrifugebuizen en zet de centrifuge tot 10.000 rpm (10.174 RCF) gedurende 30 minuten. Na voltooiing vande centrifuge cyclus, het meten van de hoeveelheid supernatant en te vervangen door een gelijk volume van verse oppervlakteactieve oplossing.
- Na resuspensie, overdracht van de schorsing van de C5 homogenisator. Start de circulatie en de terugkeer van de homogeniserende druk om 20.000 ± 2000 psi en gehomogeniseerd gedurende 30 minuten. Meet de grootte en lading van de formulering met behulp van de Zetasizer (tabel 1).
- Voer na reiniging van de unit met gedeïoniseerd water en ethanol als oplosmiddel.
- Meet de concentratie van de monsters met behulp van HPLC.
3. Sonicatie het gebruik van de Cole Parmer Ultrasone Processor
- Meet 50 ml dichloormethaan in een bekerglas. Maatregel 6 g poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) met behulp van de analytische balans, toe te voegen aan het dichloormethaan, en meng tot volledige oplossing wordt waargenomen.
- Meten 1,25 g van het geneesmiddel kristallen en toe te voegen aan het dichloormethaan / PLGA-oplossing. Mix tot volledige ontbinding te verkrijgen.
- Maak 1% polyvinylalcohol (PVA) surfactant-oplossing en koel met behulp van een ijsbad. Zorg ervoor dat het oppervlakte-actieve oplossing afkoelen is voor de toevoeging van de organische oplossing die de opgeloste geneesmiddel bevat.
- Giet het medicijn oplossing in de 1%-PVA surfactant-oplossing en start de ultrasonicator op 50% amplitude. Zorg ervoor dat het oppervlakte-actieve oplossing is geplaatst in een ijsbad. De amplitude van de ultrasoonapparaat kan worden teruggebracht tot ~ 30% amplitude voor de kleinere batches van monsters. Sonificeer het monster gedurende 10 minuten.
- Neem een kleine hoeveelheid (~ 1 mL) voor de deeltjesgrootte analyse (tabel 1). Als de grootte van de deeltjes groter is dan 1,5 micrometer, ultrasone trillingen het monster bij twee-minuten intervallen tot maximaal 16 minuten in totaal. Let op de monsters onder de microscoop op 20x en document waarnemingen (figuur 1A).
- Gebruik een roerplaat om een adequate vortex voor de resterende ophanging te creëren en het mengen van de nacht bij kamertemperatuur voortgezet.
- Weeg 8 g mannitol in een erlenmeyer en voeg 80 ml RO water. Mix tot volledige oplossing wordt waargenomen en bewaar bij kamertemperatuur. Deze zal worden gebruikt voor resuspensie na het centrifugeren, indien monsters die moeten worden gevriesdroogd.
- Verzamel de schorsing na 24 uur en giet het geheel in 50 ml centrifugebuizen. Centrifugeer de monsters met een snelheid van 8000 rpm gedurende 20 minuten bij 5 ° C. Giet het supernatant en resuspendeer een half het monster in 75 ml van gefilterde omgekeerde osmose (RO) water en de andere helft in 75 ml van 0,5% cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) oppervlakte-actieve stof.
- Centrifugeer opnieuw de monsters met een snelheid van 8000 rpm gedurende 20 minuten bij 5 ° C en resuspendeer elk van de pellets met een totaal van 20 ml mannitol oplossing.
- Na de tweede resuspensie, het meten van de grootte van de deeltjes met behulp van de Zetasizer (tabel 1).
- Gebruik geschikte flacons om de resterende schorsing overdracht en plaats ze in de vriesdroger.
- Meet de concentratie van de monsters met behulp van HPLC.
4. NanoArt Morfologie
- Neem NanoArt schorsing en kort op 20% amplitude ultrasone trillingen gedurende 5 seconden met een sonicatie sonde. Breng 10 pi van de suspensie in 1,5 ml van het RO water binnen een 1,7 mL microcentrifugebuis en vortex gedurende 10 seconden.
- Neem een 50 ul monster van het water-NanoArt oplossing en over te dragen aan een filtratie apparaat bestaat uit een Swinnex 13 polypropyleen filterhouder geassembleerd met een 0,2 micrometer polycarbonaat filtratie membraan (Nuclepore Track-geëtst). De filtratie apparaat is gevuld met 50 ul 0.2μm gefilterd gedestilleerd water voorafgaand aan de toevoeging van het verdunde geneesmiddel schorsing. Vacuüm wordt dan toegepast op het apparaat totdat de gehele oplossing volume is volledig getrokken langs de filtratie membraan.
- Zodra het membraan droog is, wordt het aangebracht op een aluminium pin stomp met behulp van dubbele stok geleidende koolstof band en sputteren bedekt met palladium. Het monster stub wordt dan afgebeeld met behulp van, in ons geval, een JEOL JSM6300F lage spanning, 'field emission scanning elektronenmicroscoop (figuur 2).
5. NanoArt Visualisatie
- Neem de voorbereide NanoArt schorsingen en ultrasone trillingen ze gedurende 10 seconden bij 20% amplitude met een sonicatie sonde.
- Neem een microscoopglaasje dekglas en het op een omgekeerde microscoop plaats. Op de cover slip mix 15 pi van de NanoArt opschorting met 100 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en meng door en neer te pipetteren meerdere malen. Visualiseer de nanodeeltjes door middel van een 20x objectief (figuur 3).
Biologie van NanoArt
6. Isolatie en Voorbereiding van Blood Borne monocyt en monocyt-afgeleide Macrofagen (MDM)
- Verkrijgen van menselijke monocyten door leukaferese van HIV-1 en hepatitis seronegatieve donoren en zuiveren de cellen door tegen de stroom centrifugale elutriatie. Beoordeel cel zuiverheid immunokleuring met anti-CD68 (kloon KP-1) Van de Wright-gekleurde cytospins 1.
- Cultuur gezuiverde monocyten in DMEM aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd gepoolde humane serum, 1% glutamine, 50 ug / ml gentamycine, 10 ug / ml ciprofloxacine en 1000 U / ml recombinant humaan macrofaag kolonie stimulerende factor (MCSF) bij een concentratie van 1x10 6 cellen / ml bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO 2. Plaat 2x10 6 cellen per well in 6-well platen en cultuur cellen gedurende 7 dagen, zodat de monocyten te differentiëren in macrofagen 1. (Figuur 3A)
7. Cel opname en Collection
- Meng NanoArt met cultuur media (zonder MCSF) tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM en voeg 1 mL van de behandeling medium aan elk putje.
- Op gewenst tijdstip, of wanneer de cellen zijn volledig geladen met NanoArt (figuur 2), verwijder dan alle behandelingen medium en was cellen drie keer met 1 ml PBS om alle deeltjes die niet in genomen door de cellen te verwijderen. In 1 ml PBS, verwijder hechtende cellen van de bodem van de put met behulp van een cel-lifter en plaats ze in een 1,7 ml microcentrifugebuis 2-4.
- Centrifugeer de cellen op 1000 RCF bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 200 pi van 100% methanol. Lyseren van de cellen en los NanoArt door kort (2-5 seconden) sonicating de korrel met een sonicating sonde op 20% amplitude. Bewaar monsters in -80 ° C tot gebruik van drugs inhoud te analyseren.
8. Intracellulaire Behoud van NanoArt
- Behandel MDM, zoals beschreven in 7.1.
- Op gewenste tijdstip, wassen cellen zoals beschreven in 7.2, maar in plaats van meteen te schrapen tot cellen, cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur vast te stellen in een oplossing van 3% glutaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) en verder ze op te lossen voor 10 minuten met 1% osmium tetroxide in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4).
- Verwijder fixatief en schraap cellen in 1 ml PBS, zoals beschreven in 7.2. Ook verzamelen en centrifuge cellen, zoals beschreven in 7.2, maar in plaats van het toevoegen van methanol aan de pellet, voeg 200 ul van de glutaaraldehyde fixeermiddel oplossing.
- Snijd celpellet in dunne (80 nm) secties met een microtoom. Vlekken op de secties met uranylacetaat en leiden citraat. Onderzoek de gekleurde delen met behulp van transmissie elektronenmicroscopie (figuur 4).
9. ART release
- Behandel cellen zoals beschreven in 7.1-7.2, maar in plaats van het verzamelen van cellen na het wassen, PBS te vervangen door 2 ml celkweek medium zonder MCSF en zonder NanoArt.
- Op aangegeven dagen, of zoals aangegeven door celkweekmedium draaien geel, uitwisseling de helft van het medium.
- Op de gewenste dag, het verzamelen van 1 ml van de cel medium samen met repliceren cellen zoals beschreven in 7,2-7,3.
- Proces-cellen zoals beschreven in 7.3. Proces medium door het toevoegen van 150 ul medium monster 1 ml van 100% methanol en vortex op volle snelheid gedurende 10 seconden. Centrifugeer de monsters op 21.000 RCF gedurende 10 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof en breng het naar een nieuwe buis. Damp de methanol met een vacuüm centrifuge, dit kan variëren van 1 tot 4 uur, afhankelijk van het monster. Bewaar monsters in -80 ° C tot aan analyse van geneesmiddelen.
10. Real-time opname van NanoArt door confocale microscopie
- Neem volwassen MDM uit stap 6.2 en etiket de cellen met behulp van een cel-labeling oplossing zoals Vybrant Cell Labeling Oplossing volgende instructie van de fabrikant. Spoel de cellen drie keer met 1 ml van de cultuur medium om overtollige kleurstof te verwijderen.
- Meng NanoArt met kweekmedium als in stap 7.1 met behulp van fluorescent gelabelde NanoArt.
- Voeg de behandeling medium met het label NanoArt onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming met een confocale microscoop. Nemen van een foto elke 30 seconden gedurende 4 uur met een 60x doelstelling 5 (Video's 1 & 2).
HIV-1 infectie en de besmettelijkheid Assays
11. HIV-1 infectie ADA
- Behandel cellen zoals beschreven in 9.1-9.3.
- Op de gewenste dag, verwijder dan alle medium en te vervangen door medium, zonder MCSF, met HIV-1 ADA bij een multipliciteit van infectie van 0,01 virale deeltjes / cel en incubeer gedurende 24 uur 1. Verwijder de virale medium en te vervangen door frisse, virus-vrije media. Cultuur cellen gedurende 10 dagen het uitwisselen van de helft van het medium om de dag of als nodig is om in leven te houden cellen (figuur 5) 6.
- Tien dagen na de infectie te verzamelen 10 pi van het medium uit elk putje, plaats in een 96-well plaat, en bewaar bij -80 ° C tot het moment van retrovirale (reverse) transcriptase analyse uit te voeren.
12. Reverse transcriptase (RT) Assay
- Met elke 10 pi monster uit stap 11,3, mix 10 pi van een oplossing die 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0,1% nonyl phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), en water bevat. Incubeer dit mengsel gedurende 15 minuten bij 37 ° C 7.
- Na de incubatie, voeg 50 ul van ijskoude 10% trichloorazijnzuur (TCA) aan elk putje. Oogst de putten op glasvezel filters, en beoordelen van de filters voor 3 H-TTP opneming van informatie door β-scintillatieteller spectroscopie 7.
13. HIV-1p24 Detecties
- Was de repliceren cellen waaruit retrovirale transcriptase medium monster werd in stap 11.3 verwijderd door spoelen met een ml PBS 3 keer.
- 'S nachts vast cellen met 4% paraformaldehyde bij 4 ° C. De volgende ochtend afspoelen cellen drie keer met PBS.
- Gebruik de muis monoklonale antilichamen tegen HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) van HIV-infectie te visualiseren. Afbeelding cellen onder helder veld met behulp van een 40x objectief (Figuur 6).
14. Representatieve resultaten:
| Drug | Maat (Nm) | PDI | Kosten (Mv) | Oppervlakteactieve stoffen |
| IDV | 1052 | 0.286 | -24.58 | 0,5% P188, 5,0% SDS, 9,25% Sucrose |
| RTV | 233 | 0.273 | -7,47 | 0,5% P188, 9,25% Sucrose |
| ATZ | 840 | 0.192 | +25.47 | 0,5% P188, 0,1% mPEG 2000-DSPE, 1,0% DOTAP, 9,25% Sucrose |
| EFV | 347 | 0.235 | -13.52 | 1,0% PVA |
Tabel 1. Fysieke kenmerken van NanoArt
Tabel geeft mogelijke representatieve waarden voor de fysieke kenmerken van NanoArt formuleringen vervaardigd met behulp van de aangegeven oppervlakte-actieve stoffen. Waarden zijn de gemiddelde diameter op basis van de intensiteit van het verstrooide licht, de polydispersiteitsindex (PDI, een schatting van de verdeling van de deeltjesgrootte), en het zeta potentieel waarden die worden verkregen voor verschillende nanoformulation monsters. Gebruikte afkortingen in de tabel: IDV: indinavir; RTV: ritonavir, ATV: atazanavir, EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS natriumdodecylsulfaat; P188: poloxameer 188 (ook wel Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly (ethyleen-glycol) 1,2-distearoyl-fosfatidyl-ethanolamine, DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 - [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl] - 3-trimethylammonium propaan.
Figuur 1. Stroomdiagram een samenvatting van de verschillende methoden gebruikt om NanoArt vervaardigen.
Figuur 1 geeft een overzicht van verschillende methoden gebruikt om NanoArt vervaardigen. Het stroomschema omvat een verwachte tijd-allotment voor elk van de kritieke fasen van de respectievelijke methoden.
Figuur 2. Representatieve beelden van gewenste en ongewenste NanoArt morfologie. Scanning elektronenmicroscopie analyse (vergroting, 15000 X) van RTV NanoArt geproduceerd door homogeniseren, nat frezen, en sonicatie op de top van een 0,2 um polycarbonaat filtratie membraan. Meet bar is gelijk aan 2,0 micrometer in alle frames. Wenselijk NanoArt bestaan, gemiddeld genomen, van de kleine (≤ 2 micrometer) self-contained deeltjes met gladde randen die de neiging hebben om dezelfde of soortgelijke vorm hebben. Ongewenste NanoArt variëren sterk in zowel de grootte en vorm en kunnen en / of stok zekering aan elkaar.
Figuur 3. Beelden van wenselijke NanoArt oplossing en van MDM toegang tot NanoArt. Helderveld microscopie beelden (alle verworven met behulp van een 20x objectief) van gehomogeniseerde RTV-NP en MDM toegang tot NanoArt. Na het combineren van 10 pi van RTV-NP-oplossing met 100 pi PBS op de top van een glazen afdekplaat slip, de deeltjes zichtbaar zijn en lijken op zand met slechts een paar van de grotere deeltjes individueel herkenbare (A). Afbeelding van volledig gedifferentieerde en spil gevormd MDM voor NanoArt behandeling (B). Nadat de cellen hebben opgenomen NanoArt, worden ze donkerder en hun kernen duidelijker geworden als gevolg van perinucleaire distributie van NanoArt, maar ze nog steeds behouden hun as gevormde cellichaam (C). Zodra de cellen wordt overstelpt met NanoArt, de kernen worden verduisterd, en de cellen worden afgerond, verliezen hun as vormige structuur en potentieel losmaken van de bodem van de put (D).
4 "/>
FIGUUR 4. Bevestiging van de cellulaire opname van NanoArt in MDM. Transmissie elektronenmicroscopie (vergroting, 15000 x) toont opname van NanoArt in MDM blootgesteld aan RTV-NP van homogenisering (A), RTV-NP van natte frezen (B), RTV-NP van ultrasoonapparaat (C), en onbehandelde cellen (D ). In de cellen, moet de NanoArt worden gemakkelijk herkenbaar door hun geometrische vorm. Let op het ontbreken van een duidelijke geometrische structuren in de controle-cel (D). Een voorbeeld van elk deeltje is geschetst: rood voor de homogenisering (A), blauw voor natte frezen (B), groen voor ultrasoonapparaat (C). Particle structuur moet lijken op wat gezien werd met behulp van SEM. Meet bar is gelijk aan 5,0 micrometer in alle frames.
Figuur 5. Diagram van de methode voor het testen van anti-retrovirale werkzaamheid van NanoArt. Met het oog op het vermogen van NanoArt te remmen virale replicatie MDM moet eerst worden behandeld met NanoArt en vervolgens blootgesteld aan HIV-1 ADA test. Net als bij de ART los studies, zijn MDM geladen met NanoArt en vervolgens gewassen om alle deeltjes die nog niet zijn geïnternaliseerd te verwijderen. NanoArt beladen MDM worden vervolgens gekweekt tot 15 dagen met een half medium wisselen om de andere dag. Gedurende deze tijd (meestal op dag 1, 5, 10 en 15) MDM worden uitgedaagd met HIV-1 ADA. Na elke virale blootstelling cellen worden gekweekt voor een ander 10 dagen, zodat de infectie tot vooruitgang. Op dag 10 na infectie media monsters worden verzameld voor RT-analyse en-cellen gefixeerd en gekleurd voor p24-antigeen. Niet-NanoArt behandeld MDM, zowel besmet en niet-geïnfecteerde, worden ook gekweekt in parallelle en getest op de aanwezigheid van p24 antigeen en RT activiteit.
Figuur 6. Testen van NanoArt werkzaamheid bij HIV-1 geïnfecteerde MDM door p24 kleuring. Helderveld beelden (20x objectief) van RTV-NP behandeld MDM 10 dagen nadat ze uitgedaagd met HIV-1 ADA. Geen infectie was aanwezig toen cellen werden uitgedaagd met virus1 dagen post-NanoArt behandeling (A); let op de aanwezigheid van NP in het cytoplasma van de meeste cellen (A inzet aangegeven met pijlen). Infectie was aanwezig toen cellen werden blootgesteld aan het virus 10 dagen na NanoArt behandeling (B), hoewel veel minder dan de cellen die niet behandeld worden met NanoArt (D), noteer het onderhouden aanwezigheid van NP in sommige cellen (B inzet aangegeven met pijlen), maar minder dan op dag 1 post-NanoArt behandeling (A inzet). Afbeelding van cellen die niet behandeld waren met NanoArt of geïnfecteerd (C); nota een gebrek aan NP binnen de cel cytoplasma (C inzet). Afbeelding van cellen die niet behandeld werden met NanoArt, maar blootgesteld aan HIV-1 ADA (D).
VIDEO: 1. Levende cel confocale microscopie van slechte RTV-NP-opname door MDM. Fluorescentie microscopie van MDM gelabeld groen met Vybrant DIO cel-labeling-oplossing en behandeld met rood-gelabeld RTV-NP. Een beeld werd genomen om de 30 seconden voor 4 uur bij 60x vergroting. Klik hier om video te bekijken
VIDEO 2. Live cell confocale microscopie van succesvolle RTV-NP-opname door MDM. Fluorescentie microscopie van MDM gelabeld groen met Vybrant DIO cel-labeling-oplossing en behandeld met rood-gelabeld RTV-NP. Een beeld werd genomen om de 30 seconden voor 4 uur bij 60x vergroting. Klik hier om video te bekijken
Discussion
NanoArt zijn ontworpen om HIV-1 therapeutica te verbeteren. We hebben voorgesteld een monocyt-macrofaag op basis van drug delivery systeem als een eerste stap om dergelijke technologieën te ontwikkelen voor klinisch gebruik en als een laboratorium testsysteem voor nanoformulated de ontwikkeling van geneesmiddelen. Ons verleden werken hebben aangetoond dat het systeem is haalbaar voor een dergelijke toepassing 5,6.
In het huidige rapport, hebben wij geïllustreerd methodes voor het synthetiseren van NP van veelgebruikte hiv-1-medicatie (indinavir, IDV, ritonovir, RTV, efavirenz, EFV en atazanavir, ATV). Dit werd bereikt door nat frezen, homogenisering en ultrasone trillingen. Belangrijk is dat onze aanpak zorgt voor wijzigingen van NanoArt fysieke kenmerken zoals grootte, vorm en lading 5,6. Door zorgvuldige selectie van oppervlakteactieve stoffen, kan men de lading van het deeltje van zeer negatieve controle op neutraal tot zeer positief. Door het veranderen van de doorlooptijd en intensiteit, kan men de grootte en maken deeltjes zo klein als ≤ 200 nm of zo groot als ≥ 3 micrometer. De vorm van het deeltje kan ook worden geregeld, maar in mindere mate dan de andere fysieke kenmerken. Kan bijvoorbeeld bolvormige deeltjes worden gemaakt via sonicatie met polymeren, terwijl multi-zijdige geometrische vormen kan worden geproduceerd via natmalen of homogenisering. Nat frezen en homogenisering produceren verschillend gevormde deeltjes, maar dit proces is afhankelijk van de fractionering methode en kan niet direct worden gecontroleerd voor. Deze eigenschappen van de fabricagemethoden kunt inschakelen onderzoeken om gemakkelijk te produceren NanoArt om de exacte specificaties van het ontwerp. Dit is van vitaal belang, omdat de fysisch-chemische eigenschappen van NanoArt hebben een krachtig effect op zowel de stabiliteit en de manier waarop ze omgaan met cellen. Zo hebben we aangetoond dat NanoArt die ongeveer 1 micrometer in omvang, een sterke positieve lading hebben, en hebben een multisided geometrische vorm worden sneller opgenomen door macrofagen, meer stabiele eenmaal binnen de cellen, en bracht over een langere periode van tijd 6.
Een methode voor het testen van NanoArt werd ontwikkeld die het mogelijk maakt voor een eenvoudige screening van de deeltjes 'vermogen om te worden opgenomen, behouden, en vrijgegeven door macrofagen, een van de belangrijkste doelwitcellen van HIV-1, in aanvulling op hun capaciteit om virale replicatie te remmen. Hierdoor kan een eenvoudig NanoArt differentiëren op basis van prestaties en degenen die de beste kans van slagen in een in vivo model, dus, waardoor zowel de efficiëntie en snelheid van de ontwikkeling van NanoArt voor menselijk gebruik zijn te identificeren.
Het is aangetoond dat de muis beenmerg macrofagen als ex vivo geladen met NanoArt en adoptief overgedragen door intraveneuze injectie in gehumaniseerd HIV-1 geïnfecteerde muizen kunnen reizen naar sites van actieve infectie, waaronder het centrale zenuwstelsel, en laat geneesmiddelen voor maximaal 2 weken om virale replicatie remmen 2-4. Bovendien zijn deze NanoArt geladen cellen werden ook in staat om effectief het aantal virus-geïnfecteerde cellen te verminderen in het plasma, lymfeklieren, milt, lever en longen en CD4 + cellen 2 te beschermen. Deze studies, hoewel voorlopig, aan te tonen dat een cel-gemedieerde NanoArt aflevering systeem kan klinisch significante hoeveelheden van de drug te verdelen om zowel bloed en geïnfecteerde weefsels. Vanwege de bemoedigende voorlopige resultaten van HIV-1 geïnfecteerde muizen studies, zijn we op dit moment het ontwikkelen van een aap immuno-deficiëntie virus besmet makaak model verder te testen van de mogelijkheden van NanoArt voor klinisch gebruik.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door subsidies 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15.635, P01MH64570, en P01 NS43985 (tot HEG) van de National Institutes of Health. De auteurs danken mevrouw Robin Taylor voor de kritische lezing van het manuscript en uitstekende grafische en literaire ondersteuning. We willen graag Steve GRZELAK bedanken voor zijn natte-frezen expertise. Wij zouden ook graag dr. Han Chen van de Universiteit van Nebraska-Lincoln elektronenmicroscopie kernfaciliteit bedanken voor het leveren van de scanning en transmissie elektronenmicroscopie beelden. Tot slot willen we Megan Marquart bedanken voor haar expertise met behulp van live confocale microscopie.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| nanoART Manufacture | ||||
| Indinavir sulfate | Reagent | Longshem Co., Shanghai, China | Cas # 157810-81-6 | |
| Ritonavir | Reagent | China Shengda Pharmaceutical Company, China | Cas # 155213-67-5 | |
| Atazanavir sulfate | Reagent | Gyma Laboratories of America INC | Cas # 198904-31-3 | |
| Effavirenz | Reagent | Hetero Labs LTD, India | Cas # 154598-52-4 | |
| PVA | Reagent | Sigma-Aldrich | P 8136 | |
| SDS | Reagent | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Sucrose | Reagent | Fluka | 84097 | |
| P188 | Reagent | Sigma-Aldrich | P 1300 | |
| mPEG 2000-DSPE | Reagent | Genzyme | LP-R4-039 | |
| Dotap | Reagent | Avanti Polar Lipid, Inc | 890890 P | |
| Hepes | Reagent | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| PLGA 75:25 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1941 | |
| Dichloromethane | Reagent | Acros Organics | 75-09-2 | |
| Mannitol | Reagent | Sigma-Aldrich | M9546 | |
| CTAB | Reagent | Sigma-Aldrich | H 9151 | |
| Analytical Balance | Tool | Denver Instrument | ||
| T-18 Mixer | Tool | IKA | ||
| Ultra Sonicator | Tool | Cole-Parmer | ||
| Wet milling, MicroCer | Tool | Netzsch Fine Particle Technology, LLC | ||
| Homogenizer, EmulsiFlex-C5 | Tool | Avestin, Inc. | ||
| Zetapotentiometer | Tool | Malvern Instruments | ||
| Gas Manifold System | Tool | Victor Technologies | ||
| In Vitro Testing | ||||
| DMEM | Reagent | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15710-064 | |
| Ciprofloxin | Reagent | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| Human MCSF | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-093-964 | |
| Pooled normal human serum | Reagent | Cole-Parmer | WU-88061-68 | |
| 6-well tissue culture plates | Tool | Corning | 3524 | |
| Methanol (HPLC Grade) | Reagent | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| 1.7 ml microcentrifuge tubes | Tool | National Scientific Company | CN1700GT | |
| Glutaraldehyde solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 49632 | |
| Osmium tetroxide solution | Reagent | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Centrifuge 5417R | Tool | Eppendorf | 022621807 | |
| F-45-30-11 fixed angle rotor | Tool | Eppendorf | 022636006 | |
| HIV-1ADA | Reagent | |||
| HIV-1 p24 mouse monoclonal antibody | Reagent | Dako | M0857 | |
| Microscope slide cover slips | Tool | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
Abbreviations used in the table: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS sodium dodecyl sulfate; P188: poloxamer 188 (also termed Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly(ethylene-glycol)1,2-distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6-[(7-nitro-2–1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]hexanoyl]-3-trimethylammonium propane); PLGA: poly(lactic-co-glycolic acid); CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCSF: Macrophage Colony-Stimulating Factor; HPLC: high-pressure liquid chromatography; HIV-1: Human Immunodeficiency Virus-1 |
||||
References
- Gendelman, H. E. Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes. J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).
- Dou, H. Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery. Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).
- Dou, H. Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages. Virology. 358, 148-158 (2007).
- Dou, H. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).
- Nowacek, A. S. Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics. J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).
- Nowacek, A. S. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).
- Kalter, D. C. Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes. J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).
