器官型海马切片培养
Summary
我们描述了一种方法来准备器官可以很容易地适应大脑的其他区域的海马。大脑切片放在多孔膜和文化传媒是可以形成一个接口。这种方法保留了长达2周文化的海马毛架构。
Abstract
海马，边缘系统的一个组成部分，起着重要的作用，在长期记忆和空间导航1。海马神经元后，可以修改其连接的实力较强的激活短暂。这种现象，长时程增强（LTP），可以持续数小时或数天，并已成为学习和记忆2的最佳人选机制。此外，定义良好的解剖和海马 3的连接已成为一个经典的模型系统研究突触传递和突触可塑性的4。
由于我们了解海马突触生理学增长和分子球员成为确定，需要操纵突触蛋白成为当务之急。海马器官型文化提供易于基因操作和精确的药物干预的可能性，但仍维持突触的组织，是了解一个更自然的背景下，比常规培养方法分离神经元突触功能的关键。
在这里，我们提出了一个方法，准备和文化，可以很容易地适应大脑的其他区域的海马。这种方法可以方便地访问基因操纵的片，用不同的方法，如病毒感染的5,6 或 biolistics 7。此外，片可以很容易地恢复为8生化分析，或转移到显微镜成像9或10电生理实验。
Protocol
1。开始之前的海马脑片的制备。 准备放置一块聚四氟乙烯板，并安装一个新的刀片组织切片机。 用70％乙醇擦拭组织培养（TC），引擎盖和设置解剖显微镜内。消毒的油烟机，显微镜，组织切片机和紫外线灯15分钟所有解剖工具。 准备6家训练班板。每孔加750μL，切片文化传媒（SCM）的每口井和地点细胞培养插入。确保彻底湿膜与无气泡下方。板块放置在孵化器在35 ° C与5％?…
Discussion
上最初Stoppini 等描述的方法，这种方法是基于 11和海马文化提供了一个快速的方式。此协议的最重要的是保持切片无菌;因此，关键是使用适当的无菌技术，并妥善消毒和消毒与组织接触的所有材料。
血清来源的不同可以影响切片质量。我们建议先测试几个批次。如果污染是一个经常出现的问题，检查孵化器和组织文化引擎盖污染的可能来源。正确使用?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国NINDS – 美国国立卫生研究院R01NS060756
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
| 6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
| Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
| Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
| Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
| Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
| Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
| Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
| CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
| MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
| D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
| Hepes | Sigma | H7523 | ||
| Sucrose | Sigma | S5016 | ||
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
| KCl | Sigma | P3911 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
Riferimenti
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Tags
Organotypic Hippocampal Slice CulturesLimbic SystemLong-term MemorySpatial NavigationHippocampal NeuronsLong-term Potentiation (LTP)Learning And MemorySynaptic TransmissionSynaptic PlasticityGene ManipulationPharmacological InterventionSynaptic ProteinsHippocampal SlicesBrain RegionsViral InfectionBiolisticsBiochemical AssaysImagingElectrophysiological Experiments
Citazione di questo articolo
Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic Hippocampal Slice Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2462, doi:10.3791/2462 (2011).