Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler
Summary
Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.
Abstract
Hipokampus, limbik sistemin bir bileşeni, uzun süreli hafıza ve mekansal navigasyon 1 önemli roller oynar. Hipokampal nöron bağlantıları güçlü aktivasyon kısa bir süre sonra gücünü değiştirebilirsiniz. Uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) olarak bilinen bu fenomen, saatler veya günler sürebilir ve öğrenme ve hafıza 2 için en iyi aday mekanizması haline gelmiştir. Buna ek olarak, 3 hipokampus iyi tanımlanmış anatomi ve bağlantı sinaptik iletim ve sinaptik plastisite 4 çalışmada klasik bir model sistem yaptı.
Hipokampal sinaps fizyolojisi anlayışımız büyüdü ve moleküler oyuncular tespit oldu, sinaptik proteinlerin işlemek için zorunlu bir ihtiyaç haline geldi. Organotipik hipokampal kültürler kolay gen manipülasyon ve hassas farmakolojik müdahale imkanı sunan ancak sinaptik organizasyon korumak, rutin kültür ayrışmış nöronlar yöntemleri daha natüralist bağlamında sinaps fonksiyonu anlamak için kritik.
Burada diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir hipokampal dilim hazırlamak ve kültür bir yöntem mevcut. Bu yöntem viral enfeksiyon 5,6 veya biolistics 7 gibi farklı yaklaşımlar kullanarak genetik manipülasyon dilimleri için kolay erişim sağlar. Buna ek olarak, dilim kolayca biyokimyasal testleri 8 için geri olabilir, ya da görüntüleme 9 veya elektrofizyolojik deneylerde 10 mikroskoplar aktarılır.
Protocol
Discussion
Bu yöntem 11 ilk Stoppini ve ark tarafından tanımlanan yöntem ve kültür hipokampal dilimleri hızlı bir şekilde sunuyor. Bu protokolün en önemli yönü dilim steril korumak için, bu nedenle uygun steril teknikler kullanmak ve düzgün doku ile temas eden tüm malzeme dezenfekte ve sterilize etmek için kritik öneme sahiptir.
Farklı serumlar kaynakları dilimleri kalitesini etkileyebilir. Biz ilk birkaç toplu test tavsiye ederiz. Kontaminasyon tekrarlayan bir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NINDS tarafından finanse edildi – NIH R01NS060756
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
| 6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
| Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
| Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
| Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
| Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
| Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
| Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
| CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
| MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
| D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
| Hepes | Sigma | H7523 | ||
| Sucrose | Sigma | S5016 | ||
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
| KCl | Sigma | P3911 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
Riferimenti
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
