En flexibel och effektiv metod för karakterisering av celltyp specifika proteiner lokalisering och nucleocytoplasmic skytteltrafik beskrivs. Denna heterokaryon tillvägagångssätt använder fluorescerande-märkta fusionsproteiner till lokaliseringar bilden protein efter cellfusion. Protokollet är mottaglig för steady-state lokaliseringar eller mer dynamiskt bestämningar baserade på levande cell imaging.
Ett stort antal proteiner regleras av subcellulära människohandel eller nucleocytolasmic skytteltrafik. Dessa proteiner visa en mångfald av cellulära funktioner inklusive kärnkraft import / export av RNA och protein, transkriptionell reglering, och apoptos. Intressant stora cellulära omorganisationer, inklusive celldelning, differentiering och transformation, innebär ofta sådan verksamhet 3,4,8,10. Den detaljerade studier av dessa proteiner och deras respektive reglerande mekanismer kan vara en utmaning som stimulans för dessa lokalisering ändringar kan vara svårfångade, och rörelserna själva kan vara ganska dynamisk och svår att spåra. Studier med cellulära onkogenes, till exempel, fortsätta att dra nytta förståelse vägar och aktiviteter protein som skiljer mellan normala primära celler och omvandlas celler 6,7,11,12. Eftersom många proteiner visa förändrade lokalisering under omvandling eller som en följd av transformation, metoder för att effektivt karaktärisera dessa proteiner och de vägar som de deltar står för att förbättra förståelsen för onkogenes och öppna nya områden för läkemedelsutveckling inriktning.
Här presenterar vi en metod för analys av protein människohandel och skytteltrafik aktivitet mellan primär och transformerade däggdjursceller. Denna metod kombinerar generationen heterokaryon fusioner med fluorescensmikroskopi att ge ett flexibelt protokoll som kan användas för att detektera steady-state eller dynamisk protein lokaliseringar. Som visas i figur 1, är två olika celltyper övergående transfererats med plasmiden konstruktioner med en fluoroprotein gen knuten till genen av intresse. Efter uttryck, är de celler som smält med polyetylenglykol och protein lokaliseringar kan sedan avbildas med en rad olika metoder. Protokollet presenteras här är ett grundläggande synsätt som specialiserade tekniker kan läggas till.
Den heterokaryon protokollet presenteras här ger en effektiv och lätt tolkningsbara metod för karakterisering av cell typspecifika lokalisering beteende samt nucleocytoplasmic skytteltrafik aktivitet. Denna metod utnyttjar känsligheten av fluorescens analys samt förmåga att bilden levande celler och utföra studier av protein dynamik. Tekniken är lätt anpassas för många olika celltyper och är mottaglig för både live och fasta cell imaging. Till exempel kan inverteras fluorescensmikroskopi användas för live-avbildning och tid förfaller video. Däremot kan monteras celler kan användas i antingen epifluorescence mikroskopi för bestämning av steady-state lokaliseringar eller mer detaljerad konfokal avbildning av diskreta lokaliseringar. Dessutom kan tekniker såsom fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) eller fluorescens förlust i fotoblekning (Flip) användas vid fastställandet av lokalisering kinetik 1. Införandet av alternativa fluoroforer i protokollet skulle möjliggöra experiment proteininteraktioner som fluorescens resonans energi överföring (FRET) skall genomföras i samråd 2. Olika hämmare av cellulära handel såsom leptomycin B eller dominerande negativa Ran GTPase konstruktioner kan användas för att fastställa beroende av viss import eller vägar export 5,6,9.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Worcester Polytechnic Institute Institutionen för kemi och biokemi för finansiering.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Effectene reagent | Qiagen | 301425 | ||
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | ||
Trypsin | Fisher | SH3023602 | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Fisher | SH30243FS | High glucose | |
paraformaldehyde | FisherChemical | O4042-500 | ||
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | ||
Hyclone Serum (fetal bovine) | Thermo Scientific | SH3008803HI | ||
Falcon 6-well plates | Fisher | 08-772-1B | ||
Polyethylene glycol 1000 | Fisher | 528875-25GM | ||
Cover slips | Fisher | 12-545-85 | ||
DABCO | Sigma-Aldrich | D2522-25G | ||
Nucleofector HDF kit | Lonza | VPD-1001 |