线虫的积极丁酮学习，短期，长期联想记忆检测

Summary

在这里，我们描述的方法来测试线虫联想学习和短期和长期的联想记忆。这些人口分析蠕虫的能力，以chemotax聘请走向挥发的气味，并形成积极的联想后，搭配食物的趋化丁酮。空调期间的人数增加导致长期记忆。

Abstract

经验和教训的信息的记忆是对生物体做出选择，帮助他们生存的关键。 C。 线虫导航环境，通过神经元特异性检测食品和化学品^气味1，2和化学^{气味3，温度} 4， ^和 5食物来源的致病关联的营养状态。

在这里，我们描述了线虫联想学习和短期和长期的联想记忆的实验。我们修改了一个厌恶的嗅觉学习范式，而不是产生了积极的回应;检测涉及挨饿〜400蠕虫病毒，然后喂养存在AWC神经遥感挥发趋化丁酮的浓度，引发低的趋化指数（类似的蠕虫Toroyama 等^7）。一个标准的人口趋assay1测试蠕虫的吸引力的气味立即分钟后调理小时。

经过调理，野生型动物的趋化丁酮增加〜0.6趋化指数的单位，其“学习指数”。联想学习是依赖于在培训期间的食品和丁酮的存在。配对为一个单一的调整期（“集结培训”）的食品和丁酮产生短期的联想记忆，持续1〜2小时。 （“间隔训练”）之间的休息时间多空调期间产生长期的联想记忆（<40小时），并依赖于cAMP反应元件结合蛋白^{（CREB），6}个长期内存跨越所需的转录因子种^8。

我们的协议还包括为快速，准确地测定趋化指数的图像分析方法。动物趋化实验板的高对比度的图像捕获和分析蠕虫计数MATLAB软件。软件修正不均匀使用一个形态tophat转型背景^的 9大津的方法是再使用，以确定一个阈值从后台单独的^蠕虫 10非常小的颗粒被删除自动和较大的非WORM地区（板边缘或琼脂拳）是手动选择删除。然后，该软件估计由单一的蠕虫病毒的大小，忽略上面指定的最大大小的区域，其余地区的平均大小。蠕虫的数量，然后除以确定蠕虫占用由一个单一的蠕虫的规模估计总面积估计。

我们发现，学习和短期和长期记忆可以区分，以及这些过程与高等生物上有着类似的关键^分子 。6,8我们的分析，可以快速测试的新的候选基因或分子，影响了学习和短期或长期在 C中的长期记忆线虫是跨物种有关。

Protocol

这些C。线虫联想学习和记忆检测需要提前准备。有关的准备工作的建议时间表，请参阅图1A中提出的时间表。还可以用身体搅拌（粗糙的移液，离心，振荡）的困扰蠕虫的记忆，可以通过过多的气味（香水等）对环境扰动和幼稚的趋化。 1。检测动物的制备培育100毫米高的生长介质（HGM）板中的蠕虫病毒（见第7.1配方）接种1毫升OP50 E.使用标准方法大肠杆菌 11。 次氯酸钠治疗妊娠成虫至少有两个人口稠密沪港板，获得了大量的鸡蛋同步人口。 注：对于最佳产量，漂白剂的第一代获得了高度同步的人口，然后漂白日2名成人的第二代，获得鸡蛋的后续步骤。 平均分配到3-4沪港接种1毫升OP50 E.板鸡蛋每个次氯酸钠大肠杆菌处理板。 注意：重​​要的是，蠕虫是耕地大量的新鲜食物，饥饿可以影响嗅觉检测结果。 在20℃孵育蠕虫为72小时左右，花费的时间为动物达到年轻的成年阶段。 2。预调节挨饿仔细检查青壮年，以确保蠕虫仍然有充足的食物沪港板，并有足够的蠕虫病毒的检测（≥200％检测板虫）。 洗净蠕虫沪港板与M9的缓冲区11到15 mL锥形管。期间至少清洗搅拌，轻轻浇几毫升到沪港板申请M9的缓冲区，并轻轻摇动板粘OP50细菌蠕虫。接下来，倾斜板，拉板使用P1000的pipetman从角落M9的缓冲区/蠕虫混合，并转移至15 mL锥形管蠕虫。如果蠕虫仍然左盘上，重复此步骤1 – 2X。 注：粗洗板，可以使管与蠕虫的位置被驱逐出来的细菌。这种细菌是不可能摆脱，并可以干扰与检测，移液管方对蠕虫 ，因为这样可能会损坏蠕虫和干涉与检测。 让蠕虫通过重力定居（ 离心机 ）。通过真空去除上清液，并用至少M9 3-4毫升。重复2X共3洗。 注：在洗涤离心将拉低到任何剩余的细菌的蠕虫人口，它可以干扰与检测。相反，轻轻地为随后的清洗添加到15毫升锥形管直接浇M9缓冲区。落户在试管底部的蠕虫应成为混合后，其除了在M9缓冲区。如果蠕虫仍然落户，轻轻倒置管组合。 第三次洗涤后，用天真的趋化分析（第5）一些蠕虫人口。 注：这是关键的工作，在所有洗涤步骤的速度相当快，蠕虫将开始挨饿，如果他们坐M9的缓冲区，它可以增加对丁酮天真的趋化太长。 加入3-4毫升M9的缓冲液15 mL锥形管，让蠕虫病毒饿死在室温下为1小时（图1B，C），M9的缓冲区。 3。短期联想记忆（集结）培训图1B为短期联想记忆检测工作流程。 在M9的缓冲区（第2），连续2μL，10％丁酮（95％乙醇）60毫米的线虫生长介质（NGM）11板已接种的盖子里面饿死期间结束500μL，OP50 E。大肠杆菌 。 注：一个良好的开端对短期和长期记忆检测的人口是≥500μL的蠕虫病毒。多个空调板，需要每基因型，以支持在培训期间的全部人口。当工作与挥发性化学物质，只有板块在必要时打开盖子，使他们在所有其他时间关闭。 从15毫升锥形管采用真空饿死蠕虫删除M9缓冲区上清和使用P1000的pipetman申请蠕虫100-200μL空调板。 注意：尝试删除尽可能多的M9的液体，使蠕虫可以迅速得到OP50的食物来源时，转移到空调板。蠕虫将坚持枪头内，可以通过移液较小的卷保守。 空调板在室温下孵育1小时（图1B）。 洗净蠕虫〜1毫升M9的缓冲板成15 mL锥形管。让蠕虫解决重力。洗一遍，直到1 – 2X M9在管内的缓冲区是明确的。 注意：使用柔和的洗涤节中所述的方法2。同样的15 mL锥形管，可用于从第2节。 最后一次洗涤后，取出真空M9缓冲区上清，并使用一些蠕虫人口趋化实验（第5），以测试为1X（集结）后，立即调理食品丁酮协会联想学习 （0分钟的时间点）。 学习指数（LI）= CI 0小时 – CI 朴素 。 其余人口的蠕虫传输到60毫米NGM的接种OP50的500μL（按住板）板。同样，适用于100-200μL每盘蠕虫，以确保有足够的细菌，以支持人口。 注：每基因型抱板的数量至少是短期的联想记忆的时间点进行测试。 孵育后调节板，在室温下（图1B）为0.5，1，或2小时（短期联想记忆的时间点）。 注：短期野生型动物的联想记忆，2小时后，训练结束。可能需要调整为不同的基因型或条件的时间点。 为了短期的食品丁酮协会的联想记忆测试，每个时间点后，轻轻洗掉板蠕虫成15 mL锥形管和1 – 2X与M9的缓冲区。趋化分析（第5）使用的蠕虫。学习指数（LI）= CI 时间点 – CI 朴素 。 注意：使用温和的清洗方法第2部分所述。每个时间点，摒弃任何不趋化实验中使用的额外的蠕虫。 4。长期的联想记忆（间隔）培训长期联想记忆检测工作流程，请参阅图1C。 按照第3节中的步骤3.1-3.2。 空调板在室温下孵育30分钟（图1C）。 按照第3步3.4。 注意：要保持30分钟的时间内，就可以开始〜25分钟的培训期间的全部清洗。 最后一次洗涤后，真空和转移蠕虫删除M9的上清液，以非种子选手60毫米NGM的牌。 注：每基因型多个板的使用并不需要在这一步，因为蠕虫正在饿死。 饿死在室温为30分钟（图1C），60毫米NGM板。 洗净放入15 m​​L锥形管与M9的缓冲区蠕虫。让蠕虫通过重力定居（ 离心机 ）。 注意：虽然应该有缓冲在这一点上没有细菌，离心可以蠕虫的一个潜在的破坏性治疗，可能会破坏长期记忆的形成。 重复步骤4.1-4.6，直到饿死已完成共7调理模块和6块 （图1C）几次。 （有代表性的时间表，请参阅表1）。 轻轻洗到15 mL锥形管关闭板块中的蠕虫病毒，并再次与M9的缓冲区的1 – 2X。 最后一次洗涤后，使用一些蠕虫人口趋化分析（第5）测试7X（间隔）后，立即调理食品-丁酮协会（0小时时间点） 的联想学习。学习指数（LI）= CI 0小时 – CI 朴素 。 其余人口的蠕虫传输到100毫米沪港OP50的1毫升（按住板）种子的板。同样，适用于100-200μL每盘蠕虫，以确保有足够的细菌，以支持人口。 注：每基因型抱板的数量至少是长期联想记忆的时间点进行测试。 100毫米NGM的板还可以用作空调板，但必须非常小心，有足够的OP50支持至少16小时的蠕虫人口。 孵育后调节板，为16，24，40小时（长期联想记忆的时间点），在20℃（图1C）。 注意：长期野生型动物的联想记忆，40小时后，训练结束。可能需要调整为不同的基因型或条件的时间点。 为了检验长期的食品丁酮协会的联想记忆，轻轻洗蠕虫关闭板成15 mL锥形管，并再次与M9的缓冲区1 – 2X后每个时间点。趋化分析（第5）使用的蠕虫。学习指数（LI）= CI 时间点 – CI 朴素 。 注意：使用温和的清洗方法第2部分所述。每个时间点，丢弃在趋化实验不使用任何额外的蠕虫。 5。趋化含量准备趋化实验板。马克非种子选手 100毫米NGM板底部与板的底部和每一方（图2A）点。 注：至少3个重复，每基因型必须运行获得统计学意义的结果。 SPOT 1μL的气味和1米楠3控制点（图2B）。 注意：请不要超过15分钟，在开始检测之前，瘫痪代理现货板， 或南3会扩散远离斑点，和动物将成为瘫痪气味或控制点才到达。穿刺琼脂，因为蠕虫会刺破地区的洞穴为NaN 3时，不小心。 尽管蠕虫在锥形管解决几个M9的缓冲液洗（第2），点1μL95％乙醇和10％丁酮后，在适当的地方上标明的检测板（图2C）（见7.2节）顶部先前发现的NaN的3。 注：前加入蠕虫（5.4节）化学品一定要看准。请注意，其中现货乙醇或丁酮。与这些化学物质挥发的工作时，要小心，只开放必要时板块的盖子，并让他们在所有其他时间关闭。 从管结算蠕虫删除尽可能多M9的缓冲区。使用一个P20的pipetman与预切头（见7.3节）提供3X 5μL，蠕虫（200-400动物）的原产地标记检测板（图2D）。 注：在使用空调前挨饿，内存检测（第2-4节），请在15 mL锥形管余下的蠕虫。蠕虫将坚持枪头内，加入少量蠕虫板节省您的蠕虫人口减少到实验板的蠕虫发布的液体量，获取。 扭曲KimWipe的角落，一个小点，并用它来吸干多余的M9的缓冲区。这将释放到检测板（图2E）的蠕虫病毒。 注意：要小心，不要与KimWipe琼脂穿刺，否则蠕虫会挖洞的起源。有些蠕虫可能会丢失在这一步，因为他们被拉到与M9缓冲区KimWipe印迹。如果使用成像和分析计算蠕虫（第6），采取板成像站前从原产地释放蠕虫病毒。原籍后立即释放蠕虫的形象会给动物总数为检测板。 孵育1小时在室温下的趋化实验板。 计数的起源，乙醇的蠕虫病毒的数量，丁酮点（图2），以及蠕虫的检测盘上的总人数。 注：一般情况下， 为 NaN 3瘫痪蠕虫将一个〜1厘米的斑点半径内，并会出现对许多动物互相堆叠坚持直。如果使用的成像和分析软件计数蠕虫（第6），采取的起源，乙醇，丁酮点的图像。应该有一个形象的蠕虫总额在5.5节。蠕虫也可以是“手算。” 计算的“趋化指数（CI）的。 CI =（[（N 丁酮 ） – （N 乙醇 )]/[(共有- N 原产 ）]。 6。蠕虫图像分析计数趋化实验板（图3A，相机设置的说明见第7.4）的蠕虫高对比度的黑色和黑白图像。为了计算趋化指数，图像需要在丁酮，乙醇，以及起源点的一个趋化实验板的检测，以及总数的蠕虫（图片起源蠕虫从他们被释放后，立即M9的缓冲液在检测开始时，第5.5节）。 注：占地约2厘米，周围各点半径的趋化实验板的图片，一般每个点捕获所有的动物。 确保一个时间点（例如天真，0小时，等）的所有试验的文件都包含在一个文件夹，命名恰当的。 趋化板为每个文件必须命名为这样：但＃PNG（丁酮点，试验＃），ORI＃PNG（起源，试验＃），ETH＃PNG（乙醇点，试验＃），TOT＃PNG。。。 （共试验＃）。 （例如，如果两个试验运行的时间点，在同一文件夹下面的文件将目前：but1.png，but2.png，eth1.png，eth2.png，ori1.png，ori2.png，tot1 。PNG，tot2.png） 打开MATLAB（见7.5节）。 在MATLAB窗口上方的“当前目录”，浏览文件夹，并选择“count_worms_v0.5.3”文件夹（M文件作为补充资料）。 在“命令”窗口“，键入”count_worms_directory（）“。按下回车键。 注：默认蠕虫的大小时，此命令是10分钟，最多80像素。要调整此基础上的一个特定的基因或发育阶段，“类型”count_worms_directory（“MINSIZE”，10“MAXSIZE'，80）”，并相应地改变像素数。 提示时，选择要分析的图像文件夹。 注：只有一个图像文件夹，可在同一时间进行分析。 图像中的每个被分析的文件夹会弹出已经设置了门槛，和选定的颗粒（图3A）。矩形工具拖动选定的颗粒不属于蠕虫删除第EM。当完成图像后，打Esc键。 文件夹中的所有图像都经过检查，4列将出现在命令窗口中：（1）图像的名称（例如but1），（2）始终“[1]”（3）计算蠕虫的平均像素大小程序中的特定形象;和（4）计算在图像蠕虫的数量。 这个程序运行后，将存款两种。csv文件（可打开Excel电子表格）到刚刚分析的图像文件夹。 “worm_counts_stats”文件提供了在命令窗口（6.9节）的输出列。 “worm_counts_summary”文件规定：（1）试验数量;蠕虫数量在5列（2），但（3）ETH，（4）ORI点;（5）总数的蠕虫病毒。 7。材料注意事项要准备100毫米高的生长介质（HGM）板（第一部分）：溶解20克Bactopeptone，盐3克，30克在700毫升蒸馏水中的细菌用琼脂。带容至1 L，用蒸馏水。经过高压灭菌，凉爽的琼脂，65℃和添加4毫升5毫克/毫升的胆固醇的乙醇中，每1 个 M 氯化钙 ，硫酸镁1米，1 米 KPO 4（pH值= 6.0）和25毫升1毫升。 使用95％乙醇，更高的百分比乙醇往往含有杂质纯化过程中，可能会影响结果。这是一个好主意，以弥补新鲜每运行检测几次丁酮10％（95％乙醇）的股票。 P20的提示必须有几毫米切断创建蠕虫适合通过一个洞足够大而不被破坏。 P1000的提示，已经有足够大的孔蠕虫适合通过。 趋化实验板成像站（图3B）在墨菲实验室FireWire相机包含了一个繁荣的立场与变倍镜头。背光是放置在一个定制的成像平台，一个玻璃顶（图3C），它允许趋化实验板，从底部照亮下方的立场底部。 “测量和自动化软件（美国国家仪器公司）是用来捕捉图像。这种成像站材料成立类似先前公布的12，可以发现在特定的试剂和仪器表。 8。代表性的成果： 一个典型的天真的趋化指数为10％丁酮野生型蠕虫（CI）的约0.2（图4A）。6集结（1X）或间隔训练（7倍）通常会增加的趋化指数0.7-0.8时间为0（图4A，CD），让一个学习型指数（李=训练有素的CI – 〜0.6天真CI）发生聚集或间隔培训的学习是非常强大。小于0.5李通常出现时有天真的趋化检测的问题，和动物有一个天真CI为0.3或更高。通常发生这种蠕虫是因为饥饿或过于拥挤的漂白和检测的开始，或者蠕虫之间的培养板坐太久M9的清洗之间的缓冲区，并开始挨饿;环境气味也可以增加幼稚的CI。饿死的蠕虫有10％丁酮高得多天真的CI（图4B）6，我们发现，与天真的趋化作用的问题，一般都提高了蠕虫的照顾和培养解决。 内存在这些实验的持续时间是趋化指数训练后立即返回到幼稚的水平，当学习指数= 0的时间。在野生型动物，通常是短期的联想记忆开始下降后1小时集结训练，持续约2小时，并且是独立的转录因子CREB（图4C）6长期联想记忆通常不会开始显着下降，直到16小时后间隔训练，长达40小时，并且CREB的依赖（图4D）6长期联想记忆可能达不到其充分发挥潜力的几个实例：（1）蠕虫没有足够的OP50 E。在30分钟的空调内的大肠杆菌;（2）细菌留在M9的缓冲区在饥饿时期;或（3）蠕虫病毒的检测（如蠕虫对管方吸管）期间损坏。 结果一般统计学意义时，4个或更多的趋化检测试验运行每时间点的基因型。运行六个复制每基因型通常会产生非常显着的效果，没有太多处理;然而，初学者可能要开始只有三个重复。一般来说，工作时间2-3基因型或条件是对那些与这些学习和记忆的实验经验丰富的舒适。 趋化实验板手计数蠕虫是非常耗费时间，可以补充实验或实验室队友之间的可变性，也可能引入分析时，我的偏见nterpreting数据。蠕虫通过图像分析（第6）计数整个实验室标准化的数据收集和分析，平均削减手工计票所需的1 / 5为经验丰富的实验室成员的数据分析时间。比较由Count_worms软件确定的使用手册蠕虫计数计算的趋化指数时，我们发现平均误差为3.07（± 1.19）​​％。 第1天 时间 步骤 9:00 1小时饿死在M9的缓冲区开始天真的趋化检测 10:00 条件＃1（60毫米食品和丁酮NGM板），30分钟结束天真的趋化实验 10:30 挨饿＃1（60毫米NGM板），30分钟 11:00 条件2＃，30分钟 11:30 挨饿2＃，30分钟 12:00 条件＃3，30分钟 12:30 挨饿＃3，30分钟 1:00 条件＃4，30分钟 1:30 挨饿＃4，30分钟 2:00 条件＃5，30分钟下午2时30分挨饿5＃，30分钟 3:00 条件6＃，30分钟 3:30 挨饿6＃，30分钟 4:00 条件＃7，30分钟 4:30 开始0小时趋化实验转移剩余的蠕虫板为16-40小时 5:30 尾0小时趋化检测 第2天 时间 步骤 8:30 开始16小时的趋化检测 9:30 结束16小时的趋化实验 表1：代表长期的联想记忆检测时间表。在这个例子中，实验开始第1天1小时上午九时在挨饿。 30分钟的条件和挨饿时期交替直到蠕虫已空调七倍。趋化实验运行的开始（天真）和结束（0小时）的培训。从开始到结束的总运行时间为8.5小时。抱板的蠕虫是趋化丁酮训练16-40小时后，第2天开始进行测试。 图1。短期和长期的联想记忆检测的工作流程。 （一）领导每天检测的准备推荐的时间表执行。 （二）短期的联想记忆法检测：饿死的蠕虫空调1小时1X学习（0分），立即通过趋化实验和测试，或与食物转移到控股板为0.5，1，或2小时后空调。 （三）长期的联想记忆法检测：饿死动物空调培训获得7块/学习或培训后16-40小时LTAM测试之前被饿死。 图2。趋检测设置。 （一）趋化实验板的原理图。标志的由来（底部）和丁酮和乙醇（左，右）点上板一把尺子或其他导向装置的帮助下，小斑点被添加到该板块。 （二）1μL，NaN的3添加到丁酮和乙醇点。 （三）丁酮10％和95％的乙醇各1μL，加点的左边或右边的板块。 （四）在M9的缓冲暂停200-400蠕虫添加到该板块的起源。 （五）到一个点扭了KimWipe是用来吸收到检测板M9的缓冲区，并释放蠕虫。 图3。蠕虫与图像分析计数。 （一）“count_worms_v0.5.3”的形象粒子选择窗口的例子。该程序打开原来的高对比的黑色和白色图像（左）与阈值的图像（中）自动弹出一个窗口。矩形工具可用于突出和消除不受欢迎的非虫“粒子”，如马克（1）检测板，板边缘（2），或琼脂穿刺（3）。 （二）图片墨菲实验室趋化实验成像站。创建高对比度图像进行分析所需的趋化实验板从底部照亮。 （三）定制示意图用于成像平台的趋化成像站。 图4：典型的联想学习和记忆的结果。 （一）天真的趋化指数的野生型蠕虫集结后的10％丁酮增加（1X）培训。据悉协会是需要配对的食物（OP50 大肠杆菌 ），丁酮。上述酒吧的数字代表“学习索引”（李= CITrained – CI天真） 。 （二）野生型天真的趋化作用大大提高至10％丁酮当蠕虫16小时饿死。改编自考夫曼等面板公元2010年6（三）野生型短期联想记忆的持续时间约2小时，并且是独立的转录因子CREB。 （四）野生型长期联想记忆的持续时间约40小时，并且CREB依赖。 补充资料 点击“imoverlay.m”文件 。 点击“count_worms_image.m”文件 。 点击“count_worms_directory.m”文件 。 点击“cellwrite.m”文件 。

Discussion

c. 在线虫嗅觉的联想学习和记忆的分析，提出了区分集结学习，行距学习，短期记忆和长期记忆的过程。依靠这些检测蠕虫的能力，意识在他们的环境^1,2的食品和化学气味，并形成两者之间的正相关^。6因此，实验是非常敏感的动物开始人口的饥饿，必须十分小心采取措施，确保美联储前和培训后，蠕虫病毒。单集结训练产生短期的联想记忆。空调期和间隔训练范式数上升是在 C中实现长期的联想记忆的关键线虫 ，因为它在其他生物体中^。6,8也许可以修改这个实验产生长期记忆的不同条件和无条件刺激之间的关联。

可以用我们的联想学习和记忆的分析，比较野生型的学习和记忆能力的老化或遗传突变的动物。例如，而联想学习和长期的联想记忆能力下降老化野生型蠕虫，学习是保持与动物的年龄与降低胰岛素信号，与学习和记忆不再是维持较长calorically限制动物随着年龄^的增长6。这些分析也适合的RNAi治疗或C.药理操纵线虫 。例如，蠕虫与DAF – 2 RNA干扰治疗可改善短期和长期的联想记忆，相反，基因转录和蛋白质的合成与药物（放线菌素D和放线菌酮），分别间隔训练期间堵塞，扰乱了长期记忆的形成。 ⁶

长期记忆是一个过程，是所有动物的生存至关重要，它出现，内存中的一个巴甫洛夫协会所涉及的分子机器大部分是从哺乳动物的蠕虫^保守 6分辨能力和测试联想学习，短短期和长期记忆使用这些嗅觉检测使得C 。 线虫一个优秀的系统内存的进一步研究，并可能为神经退化过程，导致在人类学习和记忆的丧失洞察力。

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Sodium Azide		Fisher Scientific	S227	Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof		Pharmco-Aaper	DSP-CT-18	>95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+%		Acros	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera		Edmund Optics	NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial		Edmund Optics	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator		Edmund Optics	NT55-718
8” x 8” Backlight		Schott Fostec	A08927
Standard Boom Stand		Edmund Optics	NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands		Edmund Optics	NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate		Edmund Optics	NT54-122