विकासशील कस्टम चीनी हैम्स्टर अंडाशय मेजबान सेल प्रोटीन ध्वनिक झिल्ली microparticle प्रौद्योगिकी का उपयोग कर Assays

Summary

अधिक संवेदनशील, जटिल matrices में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, स्वचालित परिणाम के लिए VIBE मंच पर कस्टम assays के विकास में वर्णित है. सार्वभौमिक कारतूस assays आसानी से कस्टम assays के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित अनुमति देता है. इस बहुमुखी प्रतिभा के तेजी से विकास और उपन्यास assays या मौजूदा पुस्तिका assays के स्वचालित संस्करणों, इस वीडियो में उदाहरण के सत्यापन के लिए सक्षम बनाता है.

Abstract

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale’s proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.

An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale’s biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.

To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.

Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Protocol

1. Microparticle तैयारी लेबल एंटीबॉडी का उपयोग बायोटिन एनएचएस रसायन विज्ञान Biotinylation की डिग्री का निर्धारण Biotinylated एंटीबॉडी के साथ संयुग्म streptavidin मोती 1-2 मिनट के लिए vortexing द्वारा मूल शीशी में मोती Resuspend एक microcentrifuge ट्यूब में मोतियों की वांछित मात्रा विभाज्य मोती PBST के साथ 3 बार धो: चुंबक पर 2 मिनट के लिए मोती युक्त ट्यूब प्लेस आकांक्षा द्वारा चुंबक पर ट्यूब के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें. मोती को बाधित नहीं सावधान रहो चुंबक से ट्यूब निकालें और 1 एमएल PBST जोड़ने 20 सेकंड के लिए भंवर मोती resuspend अपकेंद्रित्र 5 सेकंड के लिए टोपी से मोती निकाल 2.3.1-2.3.5 दो बार दोहराएँ चुंबक पर तीसरे धोने जगह ट्यूब के बाद और PBST aspirate मोती biotinylated एंटीबॉडी जोड़ें और resuspend यदि आवश्यक हो पीबीएस के साथ 300 μL biotinylated एंटीबॉडी की मात्रा लाने के. यदि एंटीबॉडी की मात्रा पहले से ही 300 से अधिक μL किसी भी पीबीएस जोड़ नहीं है भंवर प्रकार के बरतन या ट्यूब अंग को घुमानेवाली पेशी को आरटी पर 30 मिनट के लिए मनका / एंटीबॉडी निलंबन सेते PBST के साथ के रूप में कदम 3 में 3 बार धोएं. Biotinylated BSA के साथ मोती ब्लॉक तीसरे धोने के बाद 10 μg मिलीग्राम / biotinylated BSA जोड़ने के लिए, 300 μL यदि आवश्यक पीबीएस के साथ मात्रा समायोजित और 30 मिनट के लिए आंदोलन के साथ सेते PBST के साथ के रूप में कदम 3 में 3 बार धो PBS/0.05% BSA के 100 μL में मोती Resuspend. सोडियम azide दीर्घकालिक भंडारण के लिए जोड़ा जा सकता है है मानक एनएचएस fluorescein प्रोटोकॉल का प्रयोग, डिटेक्टर एंटीबॉडी fluoresceinate Fluorescination की डिग्री निर्धारित 2. HCP – विकास काम कर रहे समाधान तैयार: Fluorescein लेबल एंटीबॉडी (FL – अब): अधिकांश assays चो HCP 400 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में Fl अब का उपयोग. Fl – अब अंतिम परख मात्रा के ¼ के रूप में जोड़ा जाता है, इसलिए काम कर समाधान की एकाग्रता 1.6 μg / एमएल है. BioScale मनका / flab मंदक के साथ flab शेयर गिराए द्वारा इस समाधान तैयार करें. मोती: सबसे चो – HCP assays 2×10 5 माला / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में मोती का उपयोग करें. मनका अभिकर्मक अंतिम परख मात्रा का ¼ का गठन किया है, इसलिए काम कर समाधान की एकाग्रता 8×10 5 माला / एमएल . BioScale मनका / flab मंदक के साथ मनका शेयर गिराए द्वारा इस समाधान तैयार करें. भंवर मनका शेयर सभी मोती सुनिश्चित करें कि अच्छी तरह से पहले एक विभाज्य को हटाने के लिए निलंबन में हैं. बफर रनिंग चल रहा है बफर की संरचना करने के लिए परख के विकास में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना है, लेकिन कई चो – HCP assays 10 मिमी HEPES बफर, 1% बीच, पीएच 7.5 का उपयोग कर विकसित किया गया है हो सकता है. BioScale चल रहे विकास किट के साथ आपूर्ति की बफर है जो 1% के एक पूर्व एकाग्रता उपयोग करने के लिए बफर के लिए जोड़ा जाता है के लिए एक additive विकसित किया गया है. Calibrators और नमूने BioScale नमूना मंदक के साथ पतला. 3. VIBE सिस्टम सेट अप पर VIBE कार्य केंद्र मुड़ें प्रणाली की आपूर्ति और अपशिष्ट कनेक्ट प्रणाली प्रधानमंत्री VIBE कारतूस सम्मिलित करें ट्यूब का "नमूना सेटअप" लेबल पत्रक भरने के द्वारा परख टेम्पलेट तैयार है. BioScale प्रत्येक कार्य केंद्र VIBE परख के लिए एक परख टेम्पलेट क्षमता प्रदान करता है. इस उपयोगकर्ता को संपादित करें और अलग assays के प्रयोग के एक पूरा रिकार्ड रखने के लिए टेम्पलेट के "नोट्स" पत्रक में विशिष्ट नोट्स बचाने के लिए अनुमति देता है. प्रारंभिक परख टेम्पलेट सेट बाहर "नमूना सेटअप" पत्रक में परख में मानकों की एकाग्रता रेंज की तालिका (ऊपरी बाएँ कोने) भरने के द्वारा शुरू करो. अगले मानकों का अधिकार (सरल कॉलम सेटअप पढ़ें, एक अभिकर्मक जोड़ें और दो अभिकर्मक जोड़ें setups) VIBE वर्कस्टेशन कैसे लंबे नमूने सेते की जरूरत को हिदायत तालिका में अतिरिक्त जानकारी दर्ज करने के लिए, कितना अभिकर्मक की मात्रा को हस्तांतरित किया है कितनी देर नमूना संचय करने की जरूरत है, और क्या सेंसर कंडीशनिंग और जांच और कारतूस के परिशोधन के लिए आवश्यक हैं आदि थाली लेआउट भरें. प्लेटों में नमूना / अभिकर्मकों लोड. खिंचाव अभिकर्मक की थाली के लिए आवश्यक मात्रा में प्रदान करेगा. नमूना मात्रा में भिन्नता है, लेकिन 120 μL की कुल परख मात्रा के आधे में एक अच्छा मूल्य उस जगह है है सकते हैं. प्लेट कवर लागू करें. वर्कस्टेशन डेक पर प्लेटें लोड. परख भागो अप विज़ार्ड शुरू करने के लिए, विज़ार्ड के माध्यम से जाओ और परख शुरू. 4. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1: AMMP सैंडविच Immunoassay </p> VIBE कार्य केंद्र पर, एक AMMP परख प्रतिजन एकाग्रता के उपाय. सिग्नल मापा जाता है जब एंटीबॉडी मनका प्रतिजन hapten hapten / विरोधी hapten बातचीत के माध्यम से सेंसर करने के लिए बांधता है. पुनर्जनन सेंसर वापस प्रतिरक्षा परिसरों को हटाकर राज्य की शुरुआत के लिए लाता है है. चित्रा 2: चो HCP AMMP परख अंशांकन वक्र चित्रा 2 ऊपर एक चो HCP AMMP परख अंशांकन वक्र के एक उदाहरण है. विश्लेषण शुद्धि उच्च परिशुद्धता और reproducibility के साथ रिएक्टर सहित धारा भर से नमूनों में प्रदर्शन किया जा सकता है. चित्रा 3: एक AMMP परख अंशांकन वक्र प्रोटीन चित्रा 3 एक अवशिष्ट प्रोटीन एक AMMP परख, एक खिंचाव अवशिष्ट प्रोटीन परख किट के साथ प्रदर्शन के लिए एक अंशांकन वक्र है. एक ही किट के लिए एक 30 मिनट ऊष्मायन अवधि के साथ एक तेजी से परख, या और अधिक संवेदनशील और सटीक या सटीकता की हानि के बिना एक लंबी ऊष्मायन अवधि, आम तौर पर कर रहे हैं जो दोनों के उपयोगकर्ताओं के बराबर एलिसा से बेहतर के साथ व्यापक गतिशील रेंज के परिणाम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता ' हाथ चित्रा 4: उत्पाद टिटर AMMP परख VIBE कार्य केंद्र भी एक उत्पाद टिटर परख, आंकड़ा 4 में दिखाया गया है परिणामों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्य AMMP Assays की तुलना में अलग तरह प्रदर्शन किया, इस परख नमूना उपचार सरल कमजोर पड़ने, या मोती के अलावा अन्य की आवश्यकता नहीं है, करता है और quantitation "कोई स्पिन" नमूने viabilities के एक विस्तृत रेंज पर 10 लाख से अधिक कोशिकाओं से युक्त में सत्यापित किया गया है. चित्रा 5: जीएसटी – Gadd34 biomarker परख के लिए AMMP परख मानक वक्र चित्रा 5 में दिखाया गया है VIBE (एक पैनल) BioAnalyzer या AlphaScreen प्रौद्योगिकी पुनः संयोजक जीएसटी – Gadd34 उपयोग द्वारा प्राप्त संकेत के एक मानक वक्र. VIBE मंच पर परिणाम लगभग एक और अधिक संवेदनशील लॉग ही एंटीबॉडी का उपयोग थे. AMMP कम अभी तक बड़े कणों समाधान चरण कब्जा और पहचान जटिल गठन से अभी भी लाभ के माप leverages. चित्रा 6: ट्यूमर के नमूने में AMMP परख जीएसटी Gadd34 के लिए मानक वक्र चित्रा 6 में CWR22 xenografts से Gadd34 की प्रेरण उपस्थिति या एक boronate एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला के अभाव के रूप में या तो VIBE (एक पैनल) BioAnalyzer या AlphaScreen (पैनल बी) से विश्लेषण में परीक्षण किया गया था. VIBE मंच AlphaScreen संकेत जबकि vivo ट्यूमर xenografts में प्रोटीन की वृद्धि μg के साथ quenched था संवेदनशील, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों का उत्पादन करने में सक्षम था. इस उदाहरण के अत्यधिक जटिल नमूनों में AMMP प्रौद्योगिकी की शक्ति दिखाता है. संवेदनशील पता लगाने और चिप्स के पास चुंबक के उच्च दक्षता चिप के कारण, चुंबकीय microparticles की कम संख्या कुशलतापूर्वक और reproducibly lysed सेलुलर (lysis अभिकर्मकों सहित) और रक्त मलबे की जटिलता के बीच कम बहुतायत लक्ष्य के लिए मांजना कर सकते हैं.

Discussion

पूर्वगामी उदाहरण AMMP जटिल नमूने में बेहद संवेदनशील मात्रात्मक परिणाम प्रदर्शित करता है. इस प्रदर्शन, जब प्रणाली में अभिकर्मकों स्वरूपण के आराम और नियंत्रण के साथ दिया आवेदनों की एक किस्म के लिए सक्षम है. एक लक्ष्य के लिए उन अनुप्रयोगों विशिष्ट Gadd34 में के रूप में हो सकता है ट्यूमर में, या लक्ष्य के रूप में मेजबान कोशिका प्रोटीन और नमूने है कि शुद्धि धारा पार में पता लगाने quantitation, स्पेक्ट्रम के लिए सामान्य. कम उपरि खिंचाव मंच अत्यंत लचीला AMMP के साथ संयुक्त महत्वपूर्ण assays देने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab)
Streptavidin magnetic beads		BioScale		(10 mg/mL) ~108 beads/mg
Magnet for microcentrifuge tubes		New England BioLabs	cat # S1510S
Biotinylated BSA for blocking
Phosphate buffered saline (PBS)
PBS 0.1% Tween 20
Vortex
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator
Antibody or protein to be labeled
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF)
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9)
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm.
Diluent		BioScale		to dilute beads and FlAb
Sample Diluent		BioScale		to dilute samples and calibrators
Running Buffer Additive		BioScale