Utveckling av anpassade analyser på ViBE plattform för mer känslig, reproducerbar, automatiserad resulterar i komplexa matriser beskrivs. Den universella kassett gör analyser lätt kan anpassas för användning med anpassade analyser. Denna mångsidighet möjliggör snabb utveckling och validering av nya analyser eller automatiserade versioner av befintliga manuella analyser, exemplifierad i denna video.
Anpassad testmetoder för unika proteiner är ofta begränsade till tidskrävande manuella metoder för detektion och kvantifiering såsom ELISA eller Western blotting på grund av komplexiteten i utvecklingen på alternativa plattformar. BioScale egenutvecklade Acoustic Membrane mikropartikelenzymimmunoassay (AMMP) teknik gör smörgås immunoanalyser lätt kan utvecklas för användning på ViBE plattformen, som ger bättre känslighet och reproducerbarhet, och automatiserad drift. Som ett exempel, beskriver detta protokoll förfarandet för att utveckla en egen kinesisk hamster-värdcellen Protein (CHO-HCP) analys. De allmänna principer som redovisas här kan följas för att utveckla en mängd olika immunologiska.
En AMMP analys mäter antigen koncentration genom att mäta förändringar i oscillationsfrekvens orsakas av bindningen av mikropartiklar till sensorn för att beräkna. Det består av fyra huvudkomponenter: (1) en patron som innehåller en functionalized åtta Sensorchipet (2) antikropp märkt magnetiska mikropartiklar, (3) hapten taggade antikropp som binder till ytan av functionalized chip (4) prover som innehåller antigen av intresse. BioScale har Biosensor är ett resonant enhet som innehåller åtta olika membran med separata fluidic vägar. Membranen förändringen oscillationsfrekvens svar på massa ansamlas på ytan och denna frekvens förändring används för att kvantifiera mängden tillsatt massa.
För att underlätta användning i en mängd olika immunoanalyser sensorn är functionalized med en anti-hapten antikropp. Analysen specifika antikroppar ändras genom kovalenta konjugering av en hapten tagg till en antikropp och biotin till den andra. Den biotin etikett används för att binda antikroppar till streptavidin kombination magnetiska kulor som, i kombination med hapten-märkta antikroppar, används för att fånga analyten i en smörgås. Komplexet binder till chip genom anti-hapten/hapten interaktion. Vid slutet av varje analys köra sensorerna rengörs med en utspädd syra gör det möjligt sekventiell analys av kolumner från en 96-brunnar.
Här presenterar vi en metod för att utveckla en anpassad CHO-HCP AMMP assay för Bioprocess utveckling. Utveckla AMMP analyser eller ändra befintliga analyser i AMMP analyser kan ge bättre prestanda (reproducerbarhet, känslighet) i komplexa prover och minskad nättid. Protokollet visar steg för utveckling och diskussionsavsnittet recensioner representativa resultat. För en mer ingående förklaring av analysen optimering och parametrar anpassning kontakt BioScale. Detta kit erbjuder allmänna bioprocess utveckling analyser som Återstående Protein A, Produkt titer, och Cho-HCP.
Ovanstående exempel visar AMMP är mycket känsliga kvantitativa resultat i komplexa prover. Detta resultat, då levereras med den lätthet och kontroll av formatering reagenser i systemet gör det möjligt för en mängd olika applikationer. Dessa ansökningar kan vara specifika för ett mål, som i Gadd34 i tumör, eller generiska för ett spektrum av mål, som i värdcellen protein detektion och kvantifiering i prover som korsar rening strömmen. Den låga omkostnader ViBE plattform kombinerat med hög flexibilitet AMMP ger ett kraftfullt verktyg för att leverera kritiska analyser.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NHS-Chromogenic-biotin or NHS-Chromogenic Biotin Labeling kit | ||||
If NHS-Chromogenic-biotin is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
Phosphate buffered saline (PBS) or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
Spectrophotometer able to measure 354 and 280 nm – for measuring protein and biotin concentrations | ||||
Biotinylated antibody (2-5 biotins/Ab) | ||||
Streptavidin magnetic beads | BioScale | (10 mg/mL) ~108 beads/mg | ||
Magnet for microcentrifuge tubes | New England BioLabs | cat # S1510S | ||
Biotinylated BSA for blocking | ||||
Phosphate buffered saline (PBS) | ||||
PBS 0.1% Tween 20 | ||||
Vortex | ||||
Microcentrifuge holder for Vortex or tube rotator | ||||
Antibody or protein to be labeled | ||||
NHS-Fluorescein or NHS-Fluorescein Labeling kit | ||||
If NHS-Fluorescein is purchased as a reagent the following additional materials will be required | ||||
Water-miscible organic solvent such as dimethylsulfoxide (DMSO) or dimethylformamide (DMF) | ||||
50 mM borate, pH 8.5 or other amine free buffer (pH 7 – 9) | ||||
Desalting columns or dialysis units for buffer exchange | ||||
Measurement of protein and fluorescein concentrations requires a spectrophotometer able to measure 493 and 280 nm. | ||||
Diluent | BioScale | to dilute beads and FlAb | ||
Sample Diluent | BioScale | to dilute samples and calibrators | ||
Running Buffer Additive | BioScale |