Un ostacolo importante per le analisi biochimiche dei ribosomi contenente nascente peptidil-tRNA è stata la presenza di ribosomi altri nei medesimi campioni, i ribosomi non coinvolti nella traduzione della sequenza di mRNA specifico oggetto di analisi. Abbiamo sviluppato una metodologia semplice per purificare, esclusivamente, i ribosomi contenente il nascente peptidil-tRNA di interesse.
Recentemente, studi strutturali e biochimici hanno dettagliato molti degli eventi molecolari che si verificano nel ribosoma durante l'inibizione della sintesi delle proteine dagli antibiotici e durante la sintesi polipeptidica nascente. Alcuni di questi antibiotici, e di regolamentazione polipeptidi nascenti per lo più in forma di peptidil-tRNA, inibire sia la formazione di legame peptidico o cessazione traduzione 1-7. Questi eventi inibitori può fermare il movimento del ribosoma, un fenomeno definito "arresto traslazionale". Arresto traduzione sia indotta da un antibiotico o di un polipeptide nascente ha dimostrato di regolare l'espressione di geni coinvolti in diverse funzioni cellulari quali la crescita cellulare, la resistenza agli antibiotici, traslocazione metabolismo delle proteine e delle cellule 8-13. Conoscenza di come antibiotici e regolamentari polipeptidi nascenti alterano la funzione dei ribosomi è essenziale se si vuole comprendere il ruolo completo del ribosoma in traduzione, in ogni organismo.
Qui, descriviamo una metodologia semplice che può essere usato per purificare, esclusivamente, per l'analisi, i ribosomi traduzione di un mRNA specifico e contenente uno specifico peptidil-tRNA 14. Questa procedura è basata su isolamento selettivo dei ribosomi tradurre associato a un marcato con biotina mRNA. Questi complessi traslazionale sono separati da altri ribosomi nella miscela stessa, utilizzando perline paramagnetici streptavidina (SMB) e un campo magnetico (MF). MRNA marcato con biotina sono sintetizzati dal run-off test trascrizione utilizzando come modelli PCR generati frammenti di DNA che contengono promotori T7 trascrizionale. T7 RNA polimerasi incorpora biotina-16-UMP dalla biotina-UTP; nelle nostre condizioni circa dieci biotina-16-UMP molecole sono incorporate in un mRNA 600 nt con un contenuto del 25% dell'Ump. Questi biotina marcata con mRNA vengono poi isolate, e utilizzati di test in vitro traduzione eseguita con fattore di rilascio 2 (RF2)-impoverito cell-free estratti ottenuti da ceppi di Escherichia coli contenenti wild-type o mutante ribosomi. I ribosomi tradurre la biotina marcata con sequenze di mRNA sono in stallo presso la regione codone di stop, per l'assenza della proteina RF2, che compie normalmente terminazione traduzione. Ribosomi in fase di stallo che contiene il nuova sintesi peptidil-tRNA sono isolati e rimossi dalle reazioni traduzione usando SMB e un MF. Queste perle solo legano biotina contenenti messaggi.
L'isolato, complessi traslazionale, può essere utilizzato per analizzare le caratteristiche strutturali e funzionali di tipo selvatico o mutanti componenti ribosomiale, o peptidil-tRNA sequenze, oltre a determinare l'interazione ribosoma con antibiotici o altri fattori molecolari 1,14-16. Per esaminare la funzione di questi complessi isolati ribosoma, peptidil-transferasi analisi può essere eseguita in presenza dell'antibiotico puromicina 1. Per studiare i cambiamenti strutturali in complessi traslazionale, procedure consolidate possono essere utilizzate, come me) reticolazione a specifici amminoacidi 14 e / o ii) test di protezione alchilazione 1,14,17.
Questa procedura di isolamento descritti in questo rapporto è altamente riproducibile. Purtroppo, la presenza di brevi peptidil-tRNA prodotto da le stesse sequenze tradotti non può essere comodamente evitati; quali peptidil-tRNA può corrispondere al 15-20% del materiale totale isolato (Figura 2C). Questi contaminanti possono aumento della concentrazione quando più alte concentrazioni di mRNA marcati con biotina sono stati utilizzati o quando la cella senza estratti utilizzati sono vecchi o sono stati riutilizzati più volte. Pertanto, è molto importante controllare la qualità e la concentrazione dei componenti della traduzione nelle reazioni in vitro. In alternativa, commerciali ad alta efficienza ricostituito cell-free estratti sono disponibili che possono essere utilizzati per le stesse finalità (sistema PURE) 18.
Utilizzando questo metodo, biotina-16-UMP è incorporato in modo casuale su tutta la lunghezza del mRNA bersaglio. C'è la possibilità che alcuni ORF contenente tratti uridina può avere incorporato questo modificate nella loro sequenza nucleotidica, agendo sulla loro traduzione. Variabile concentrazione relativa di biotin-16-UTP/UTP devono essere testati durante la sintesi del mRNA al fine di ottenere la traduzione più efficiente. Metodi alternativi di etichettatura biotina può essere utilizzato e destinato alle 5'-end, la fine più stabile del mRNA. (I) biotina può essere collegato al 5'-end del mRNA con 3'-NH2ATP (3'-amino, 3'-deossiadenosina trifosfato) e T4 RNA ligasi 19. (Ii) 5'-end biotina marcata oligonucleotide può essere collegato al 5'-end del mRNA tramite ligasi T4 RNA e 20. (Iii) 3'-end biotina-etichettati oligodeossinucleotidi che corrispondono alla sequenza complementare al 5'-end del mRNA potrebbe anche essere utilizzato per isolare i complessi traduzione. Queste oligodeossinucleotidi biotina etichettati potrebbe essere collegato al SMB prima dell'isolamento. In seguito la SMB attaccato al biotina-etichettati oligodeossinucleotidi potrebbe essere miscelato con la miscela di reazione traduzione per consentire l'interazione con le loro sequenze di mRNA complementare. Dopo l'isolamento, l'ibrido RNA-DNA regione – e la regione ibridazione tra il oligodeoxynucleotide biotina-etichettati e la sequenza di mRNA – potrebbe essere degradata mediante RNasi H, che separa i complessi in fase di stallo dal perline streptavidina. Questo metodo alternativo può permettere i complessi da utilizzare in futuro le analisi strutturali mediante metodi di risoluzione più elevata.
The authors have nothing to disclose.
LRC-V. vuole dedicare questo lavoro alla memoria del Dr. Adriel D. Johnson, un professore la cui meravigliosa priorità numero uno è sempre stata la formazione degli studenti. Ci manchi, Adriel. Siamo grati a Jacqueline Moreno per il suo aiuto nello svolgimento degli esperimenti descritti in questo studio. Questo studio è stato sostenuto da una borsa di CY fornito dalla National Science Foundation, MCB-0615390, e da start-up fondi previsti per LRC-V. presso la University of Alabama a Huntsville.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris base | Sigma | 252859 | ||
Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
SMB | Promega | Z5482 | ||
Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
ATP | Sigma | A7699 | ||
GTP | Sigma | G8877 | ||
PEP | Sigma | P7002 | ||
PK | Sigma | P7768 | ||
Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
Spermidine | Fluka | 85558 | ||
tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
Tricine | Sigma | T5816 | ||
L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
DTT | Fluka | 43815 | ||
magnetic separation stands | Promega | Z5342 |