軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作
Summary
アプリケーションと2000から1000 microdyneの範囲内のニューロンに作用する力の直接測定は、校正済みのガラス針を用いて高精度で実現されています。この方法論は、軸索の開始、軸索張力、軸索伸長の速度、および力ベクトルを含む、軸索の開発のいくつかの側面を、制御および測定に使用することができます。
Abstract
セルの操作と神経軸索の延長は、10から1000μdyne範囲の1,2の力を測定し、適用可能な校正済みガラスのマイクロファイバーを使用して行うことができます。力の測定は、直接、経験的な方法3によって校正されているガラス針の曲げHookeanの観察を通して得られる。 、製造校正、治療、および細胞に針を使用するための機器の要件と手順が詳しく説明されています。力は、これらの技術は方法論の柔軟性を示すが適用されていると、将来の検討4-6の例として与えられるために以前に使用し、異なる細胞型の制度。技術的な利点は、操作によって生成される力の継続的な"可視化"し、直接携帯電話のさまざまなイベントに介入できることです。と同様に剥離し、培養細胞8の任意のタイプの機械的な測定は、これらは直接的な刺激や軸索の成長と収縮7の規定が含まれています。
Protocol
1。ガラス針を作る。 調整可能なマイクロニードルプラーは、4の長さはmmと固体のビームを閉じている約テーパー先端に針を製造するために使用されます。長く柔軟な先端とは対照的に、この短い4 mmの長さは、実験中の針の先端の振動を制限する。ファイバーの先端ほとんどの1ミリメートルの直径は2.5μmである間に4mmの繊維の近位領域では、針は、1mm以内ガラス管の直径から15μmで…
Discussion
携帯電話の力を適用し、測定する技術は長い歴史9持っている。我々の方法は、もともと私たちと電動油圧装置10を用いて一定速度で"けん引"神経細胞に似たガラスの針を使用デニスブレイ、の作業が動機とされた。ステッピングモータ11、磁気ビーズ12、微細加工ビーム13と流体の流れ14：含まれる細胞に力を適用することの多くの代替?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は感謝してこの方法論の開発で博士ロバートE. Buxbaumの重要な貢献を認識する。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| R-6 cap. Tube | Drummond Scientific Co., Broomall, PA, USA | 9-000-3111 | R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8″ | |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Geneva, Switzerland | BB-CH puller | Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 | |
| 0.001″ Chromel wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCH-001-50 | unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega | |
| 0.003″ Constatan wire | Omega Engineering, Stamford, CT, USA | SPCI-003-50 | unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool | |
| fine forceps | Fine Science Tools, USA | 91150-20 | Dumont Inox #5 | |
| universal microscope boom stand | Nikon | 76135 or 90430 | most brands or types of boom stand will work for this use | |
| mechanical micromanipulator | Narishige | M-152 | three-axis direct-drive coarse micromanipulator | |
| hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-203 | now available as MMO-203, three movable axis type | |
| needle holder | Leica Microsystems | 11520145 | set of 3 | |
| single instrument holder | Leica Microsystems | 11520142 | ||
| double instrument holder | Leica Microsystems | 11520143 | ||
| mechanical micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | post mount,1 prob holder, RH Model 430001 | |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | ||
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | inverted microscope | ||
| Vibraplane isolation table | Kinetic System, Boston, MA, USA | 1200 series | ours is model 1201-02-12 | |
| Ringcubator | self manufactured see reference 19 | reference 19, requires updated controller listed below | ||
| programable temperature controller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | replaces the retired PXV3 temperature controller | |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments, Inc. | inverted microscope, circa 1980 | ||
| Nikon SMZ-10 binocular dissecting | Nikon Instruments, Inc. | other dissecting microscopes will work |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Lamoureux, P., Heidemann, S., Miller, K. E. Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development. J. Vis. Exp. (50), e2509, doi:10.3791/2509 (2011).