Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide comme un modèle de l'épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour l'isolement, la culture et d'exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante, afin d'étudier les réponses moléculaires à cette toxine de l'environnement.
Cellules épithéliales pulmonaires peuvent être isolés par les voies respiratoires des souris et cultivés à interface air-liquide (ALI) comme un modèle de l'épithélium respiratoire différencié. Un protocole est décrit pour isoler et exposer ces cellules à la fumée de cigarette dominante (CS), afin d'étudier les réponses des cellules épithéliales de l'exposition CS. Le protocole se compose de trois parties: l'isolement des cellules épithéliales des voies aériennes de la souris la trachée, la culture de ces cellules à l'interface air-liquide (ALI) comme complètement différenciées des cellules épithéliales, et la livraison de courant calibrée CS à ces cellules en culture. Le système de culture permet ALI la culture de l'épithélium respiratoire dans des conditions qui ressemblent davantage à leur environnement physiologique que les systèmes ordinaires de culture liquide. L'étude de la biologie moléculaire et du poumon réponses cellulaires à l'exposition CS est un élément essentiel de comprendre l'impact de la pollution de l'air ambiant sur la santé humaine. Les résultats des recherches dans ce domaine peuvent finalement contribuer à la compréhension de l'étiologie de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), et d'autres maladies liées au tabac, qui représentent d'importants problèmes de santé mondiaux.
Le protocole décrit l'isolement de la souris des cellules épithéliales trachéales est adaptée à partir des protocoles de You et coll., 1, et d'autres 2-3 avec des modifications. Comme avec n'importe quelle cellule isolements protocole décrivant l'aspect le plus essentiel est d'éviter la contamination par des pathogènes bactériens ou fongiques en utilisant des techniques aseptiques strictes. Une seconde étape essentielle est d'éviter la contamination des …
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Emeka Ifedigbo d'assistance technique et le Dr Shivraj Tyagi d'expertise précieuse. Nous remercions également le Centre NeuroDiscovery Harvard pour l'assistance à la microscopie. Ce travail a été soutenu en partie par une American Heart Association prédoctorale octroi d'09PRE2250120 Hilaire Lam, et des subventions des NIH, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, décerné à AMK Choi.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
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Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).