Pulmonell epitelceller kan isoleras från luftvägarna hos möss och odlade på luft-vätska gränssnitt som en modell för differentierade respiratoriska epitelet. Ett protokoll beskrivs för isolering, odling och utsätta dessa celler för att integrera cigarettrök, för att studera molekylära reaktioner på detta miljögift.
Pulmonell epitelceller kan isoleras från luftvägarna hos möss och odlade på luft-vätska gränssnitt (ALI) som en modell för differentierade respiratoriska epitelet. Ett protokoll beskrivs för att isolera och utsätta dessa celler att integrera cigarettrök (CS), för att studera epitelceller svar på CS exponering. Protokollet består av tre delar: isolering av luftvägarna epitelceller från mus luftstrupen, den odling av dessa celler vid luft-vätska gränssnitt (ALI) som fullt differentierade epitelceller, och leverans av kalibrerade mainstream CS till dessa celler i kultur. ALI kulturen systemet tillåter kulturen i andningsorganen epitel under förhållanden som mer liknar deras fysiologiska inställning än det vanliga flytande kultur. Studier av molekylära och lungor cellulära svaren på CS exponeringen är en kritisk komponent för att förstå effekterna av miljön luftföroreningar på människors hälsa. Forskningsresultat inom detta område i slutändan kan bidra till att förstå etiologi kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) och andra tobaksrelaterade sjukdomar, som utgör stora globala hälsoproblemen.
Protokollet beskriver isolering mus trakeal epitelceller är anpassad från protokoll av dig et al., 1, och andra 2-3 med ändringar. Som med alla protokoll som beskriver cell isoleringar, är den mest kritiska aspekten att undvika kontamination från bakterie-eller svamppatogener genom att använda strikt aseptisk teknik. Ett andra viktigt steg är att undvika fibroblast kontaminering av kulturer, vilket kan undvikas genom noggrann dissekering av tracheas, och negativa urval som beskrivs …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Emeka Ifedigbo för tekniskt bistånd och Dr Shivraj Tyagi för värdefulla expertis. Vi tackar också Harvard NeuroDiscovery Centrum för hjälp med mikroskopi. Detta arbete stöddes delvis av ett American Heart Association Predoctoral bevilja 09PRE2250120 till Hilaire Lam och NIH bidrag, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, tilldelades AMK Choi.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).