Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface
Summary
Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen isoliert und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels. Ein Protokoll ist für die Isolierung, Kultivierung und Freilegen dieser Zellen zu Mainstream Zigarettenrauch beschrieben, um molekulare Antworten zu diesem Umweltgift zu studieren.
Abstract
Pulmonale Epithelzellen aus den Atemwegen von Mäusen und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) als ein Modell der differenzierten respiratorischen Epithels isoliert werden. Ein Protokoll ist für die Isolierung und die Preisgabe dieser Zellen Mainstream Zigarettenrauch (CS) beschrieben, um epithelialen Zell-Antworten auf CS Exposition zu studieren. Das Protokoll besteht aus drei Teilen: der Isolierung von Epithelzellen der Atemwege von der Maus Luftröhre, die Kultivierung dieser Zellen an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) als ausdifferenzierten Epithelzellen und die Lieferung von kalibrierten Mainstream CS, diese Zellen in Kultur. Die ALI Kultur-System ermöglicht die Kultur des respiratorischen Epithelien unter Bedingungen, die mehr ähneln ihren physiologischen Einstellung als gewöhnliche flüssige Kultur-Systemen. Die Untersuchung der molekularen und zellulären Reaktionen auf Lunge CS Exposition ist ein kritischer Faktor für das Verständnis der Auswirkungen von Umweltfaktoren Luftverschmutzung auf die menschliche Gesundheit. Forschungsergebnisse in diesem Bereich kann letztlich zum Verständnis der Ätiologie der chronisch-obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) und andere Tabak-bedingten Krankheiten, die wichtigsten globalen Gesundheitsprobleme darstellen beitragen.
Protocol
Discussion
Das Protokoll beschreibt Isolierung von Maus tracheale Epithelzellen aus den Protokollen der Sie et al angepasst., 1, und andere 2-3 mit Modifikationen. Wie bei jedem Protokoll beschreibt Zelle Isolationen, ist der wichtigste Aspekt, um eine Verunreinigung durch bakterielle oder pilzliche Erreger durch strikte aseptische Techniken zu vermeiden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist, Fibroblasten-Kontamination der Kulturen, die durch sorgfältige Präparation der Luftröhre vermieden werden kö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Emeka Ifedigbo für technische Unterstützung und Dr. Shivraj Tyagi für wertvolles Know-how. Wir danken auch der Harvard NeuroDiscovery Zentrum für Unterstützung bei der Mikroskopie. Diese Arbeit wurde teilweise durch eine American Heart Association Predoctoral gewähren 09PRE2250120 zu Hilaire Lam, und NIH Zuschüsse, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, verliehen an AMK Choi unterstützt.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602E | ||
| Pronase | Roche | 10165921001 | Streptomyces griseus | |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | From rat tail | |
| Acetic Acid | Sigma | 338826-25 | ||
| DNaseI | Sigma | DN25-100MG | From Bovine Pancreas | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V | |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | ||
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14175 | Without Ca++ or Mg++ | |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES | |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma | 83264-100ML | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513-100ML | 200 mM | |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | ||
| Insulin | Sigma | 16634-50MG | Bovine Pancreas | |
| Apo-transferrin (human) | Sigma | T1147-100MG | ||
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Vibrio Cholerae | |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse | |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | ||
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | ||
| Transwell | Corning Costar | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
|
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon | 353803 | ||
| Pallflex membrane | Pall Life Sciences | EMFAB TX40H120-WW | ||
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14″x14″x20″ Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2″ thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2″ size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2′ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector.
This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com).
Riferimenti
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