Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen
Summary
In deze video laten we zien visualisatie van PKC translocatie in levende cellen met behulp van fluorescent gelabelde PKCS.
Abstract
Protein kinase Cs (PKCS) zijn serine threonine kinasen die een centrale rol spelen in het reguleren van een breed scala van cellulaire processen zoals celgroei en leren en geheugen. Er zijn vier bekende families van PKC isovormen in vertebraten: klassieke PKCS (α, βI, βII en γ), nieuwe type I PKCS (ε en η), nieuw type II PKCS (δ en θ), en atypische PKCS (ζ en ι ). De klassieke PKCS worden geactiveerd door Ca 2 + en diacylclycerol (DAG), terwijl de roman PKCS worden geactiveerd door DAG, maar zijn Ca 2 +-onafhankelijk. De atypische PKCS worden geactiveerd door geen van beide Ca 2 + of DAG. In Aplysia californica, ons model systeem om geheugenvorming studeren, zijn er drie zenuwstelsel specifieke PKC isovormen een van elke grote klasse, namelijk de conventionele PKC Apl I, de roman type I PKC Apl II en de atypische PKC Apl III. PKCS zijn lipide-geactiveerde kinasen en dus de activering van klassieke en nieuwe PKCS in reactie op extracellulaire signalen is vaak gecorreleerd met PKC translocatie vanuit het cytoplasma naar de plasmamembraan. Daarom heeft het visualiseren van PKC translocatie in real-time in levende cellen worden een waardevol hulpmiddel voor het ophelderen van de signaaltransductiewegen die leiden tot PKC activering. Zo heeft deze techniek mogelijk voor ons om vast te stellen dat de verschillende isovormen van PKC transloceren onder verschillende omstandigheden op verschillende soorten van synaptische plasticiteit bemiddelen en dat serotonine (5HT) activering van PKC Apl II vereist productie van zowel DAG en fosfatidinezuur (PA) voor de translocatie 1-2. Belangrijk is dat de mogelijkheid om dezelfde neuron te visualiseren heeft herhaaldelijk ons toegestaan, bijvoorbeeld om desensitisatie van de PKC respons in verfijnde details maatregel 3. In deze video, we elke stap van de voorbereiding Sf9 celculturen tonen, hebben culturen van Aplysia sensorische neuronen zijn beschreven in een ander video-artikel 4, uiten van fluorescent gelabelde PKCS in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen en live-imaging van PKC translocatie in reactie op verschillende activatoren met behulp van laser-scanning microscopie.
Protocol
Discussion
We hebben een techniek beschreven om de afbeelding translocatie van fluorescent gelabelde PKCS in real-time in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen. Sf9-cellen zorgen voor een eenvoudig systeem om de afbeelding PKC translocatie sinds het kweken en transfecteren ze is vrij straight-forward. In tegenstelling tot micro-injectie van Aplysia sensorische neuronen kost wat tijd te beheersen, tot een paar maanden. Moeilijkheden in verband met deze techniek ook elektrode verstopping. Het filteren van d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Grant aan Wayne S. Sossin. Carole A. Farah is de ontvanger van een postdoctorale beurs van het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec (FRSQ) en een Conrad Harrington fellowship. De auteurs willen graag met Joanna Bougie, Margaret Hastings en Margaret Labban bedanken voor hun hulp met de video te schieten en Madeline Richmond Pool voor hulp bij het grafisch overzicht.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
Riferimenti
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
