पूरे पर्वत का उपयोग बगल में आण्विक और organismal जीवविज्ञान लिंक संकरण
Summary
पूरे माउंट<em> बगल में</em> संकरण (इच्छा) एक ऊपरी स्तर स्नातक dissections हड्डीवाला अलावा में तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम में इस्तेमाल किया गया था. यह छात्रों के लिए जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के रूप में सकल शरीर रचना के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन, एक पाठ्यक्रम के भीतर आणविक और organismal जीव विज्ञान के अध्ययन को जोड़ने का अवसर दिया.
Abstract
Whole mount in situ hybridization (WISH) is a common technique in molecular biology laboratories used to study gene expression through the localization of specific mRNA transcripts within whole mount specimen. This technique (adapted from Albertson and Yelick, 2005) was used in an upper level undergraduate Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom at Syracuse University. The first two thirds of the Comparative Vertebrate Biology lab course gave students the opportunity to study the embryology and gross anatomy of several organisms representing various chordate taxa primarily via traditional dissections and the use of models. The final portion of the course involved an innovative approach to teaching anatomy through observation of vertebrate development employing molecular techniques in which WISH was performed on zebrafish embryos. A heterozygous fibroblast growth factor 8 a (fgf8a) mutant line, ace, was used. Due to Mendelian inheritance, ace intercrosses produced wild type, heterozygous, and homozygous ace/fgf8a mutants in a 1:2:1 ratio. RNA probes with known expression patterns in the midline and in developing anatomical structures such as the heart, somites, tailbud, myotome, and brain were used. WISH was performed using zebrafish at the 13 somite and prim-6 stages, with students performing the staining reaction in class. The study of zebrafish embryos at different stages of development gave students the ability to observe how these anatomical structures changed over ontogeny. In addition, some ace/fgf8a mutants displayed improper heart looping, and defects in somite and brain development. The students in this lab observed the normal development of various organ systems using both external anatomy as well as gene expression patterns. They also identified and described embryos displaying improper anatomical development and gene expression (i.e., putative mutants).
For instructors at institutions that do not already own the necessary equipment or where funds for lab and curricular innovation are limited, the financial cost of the reagents and apparatus may be a factor to consider, as will the time and effort required on the part of the instructor regardless of the setting. Nevertheless, we contend that the use of WISH in this type of classroom laboratory setting can provide an important link between developmental genetics and anatomy. As technology advances and the ability to study organismal development at the molecular level becomes easier, cheaper, and increasingly popular, many evolutionary biologists, ecologists, and physiologists are turning to research strategies in the field of molecular biology. Using WISH in a Comparative Vertebrate Biology laboratory classroom is one example of how molecules and anatomy can converge within a single course. This gives upper level college students the opportunity to practice modern biological research techniques, leading to a more diversified education and the promotion of future interdisciplinary scientific research.
Protocol
Discussion
काश एक तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान प्रयोगशाला पाठ्यक्रम में इस्तेमाल किया गया था करने के लिए छात्रों को ज्ञात जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के दृश्य के माध्यम से शारीरिक विकास में आनुवंशिकी की भूमिका को समझने में मदद. पाठ्यक्रम के पहले भाग के लिए, छात्रों को कई अलग कोरडेट taxa का प्रतिनिधित्व जीवों पर dissections प्रदर्शन, उन्हें पर्याप्त समय का अध्ययन, समझने की, तुलना, और इसके विपरीत हड्डीवाला शरीर रचना विज्ञान दे.
पाठ्यक्रम के दूसरे भाग के लिए एक परिचय के रूप में, छात्रों को एक औपचारिक zebrafish विकास और शारीरिक रचना का वर्णन व्याख्यान दिए गए. तरीकों और इच्छा प्रयोग के अपेक्षित परिणाम भी विचार – विमर्श किया गया. छात्रों को तो somitogenesis और विकास के रस्मी-6 चरणों में थे रहते zebrafish दिया, और 2 और 5 दिनों के बाद निषेचन (DPF) पर विदारक माइक्रोस्कोप के तहत जांच करने के लिए. यह छात्रों zebrafish भ्रूण की तरह लग की एक बेहतर समझ और morphological परिवर्तन के प्रकार है कि ontogeny अधिक होने दे रहा था.
अगले प्रयोगशाला सत्र में छात्रों को zebrafish भ्रूण में जो इच्छा पहले किया गया था दिया गया. वे अध्ययन के लिए और ब्याज की प्रत्येक जीन (प्रयुक्त riboprobe) के लिए जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का वर्णन करने के लिए पूछा गया. इच्छा के लिए इस्तेमाल किया भ्रूण एक विषमयुग्मजी ace/fgf8a लाइन के सदस्यों के बीच matings से प्राप्त किए गए . Mendelian वंशानुक्रम के आधार पर, ace/fgf8a matings से भ्रूण के 25% homozygous म्यूटेंट और संरचनात्मक इस पाठ्यक्रम में पर ध्यान केंद्रित संरचनाओं के कई दोष प्रदर्शन की उम्मीद थी . एलबर्टसन प्रयोगशाला में प्रकाशित रिपोर्ट और अप्रकाशित टिप्पणियों के आधार पर, मस्तिष्क और अनुचित दिल पाशन में दोष, somites में दोष (; एलबर्टसन और Yelick, 2005, व्यक्तिगत टिप्पणियों एट ब्रांड अल, 1996) के रूप में अच्छी तरह के रूप में की उम्मीद थी.
छात्रों को सभी नमूनों, जंगली प्रकार (विषमयुग्मजी जानवरों के विकास के प्रारंभिक चरणों में जंगली प्रकार भाई बहन से अप्रभेद्य हैं) और homozygous म्यूटेंट की जांच करने के लिए कहा गया प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न प्रस्तुत के लिए. वे तो उनके परिणाम का वर्णन करने के लिए प्रयोगशाला रिपोर्ट लिखने के लिए कहा गया, और शरीर रचना विज्ञान और आनुवंशिकी, कैसे दोषपूर्ण जीन की अभिव्यक्ति शारीरिक विरूपताओं उपजी हो सकता है की अपने ज्ञान के आधार पर.
छात्रों के लिए उत्साह और जिज्ञासा के साथ इस प्रयोगशाला व्यायाम प्राप्त करने के लिए लग रहा था. हाल इच्छा से पहले इस्तेमाल कभी नहीं किया था और पाठ्यक्रम के इस भाग में अत्यंत रुचि रखते थे. छात्र zebrafish पेचीदा भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति की अलग पैटर्न मिला, कुछ भी वर्णित धुंधला पैटर्न उन्हें अच्छी तरह से ज्ञात डिजाइन और एक Smiley चेहरे के रूप में इस तरह के प्रतीकों, के साथ जोड़ द्वारा visualized. परिणामस्वरूप प्रयोगशाला की रिपोर्ट से पता चला छात्रों इच्छा प्रोटोकॉल और विशिष्ट शारीरिक संरचनाओं में जीन की अभिव्यक्ति के एक सामान्य समझ था. 2008b गीता – Loganathan एट अल, Huelsken एट अल, 2002; गीता – Loganathan एट अल, 2008a. छात्रों को भी जीन की विशिष्ट कार्यों को समझने के लिए आवश्यक थे प्रयोगशाला (Stickney एट अल, 2000 के दौरान करना चाहते हैं का उपयोग का अध्ययन ). यह स्पष्ट तथापि, कि कुछ छात्रों को संकेत दे रास्ते के सीमित पृष्ठभूमि ज्ञान और ब्याज की जीन था. में इन अवधारणाओं के बारे में अधिक जानकारी चाहते हैं कि परिचयात्मक व्याख्यान भविष्य तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रमों में इच्छा का उपयोग करने के लिए एक स्वागत योग्य इसके अलावा हो सकता है.
के बाद से लगातार चार दिनों प्रोटोकॉल आम तौर पर लेता है, पाठ्यक्रम के समय पर निर्भर करता है, छात्रों को केवल वर्ग और प्रशिक्षक शेष के लिए जिम्मेदार होना चाहिए में प्रयोग का एक हिस्सा पूरा करने में सक्षम हो सकता है. हमारे तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान कक्षा में छात्रों को प्रयोगशाला में धुंधला प्रतिक्रियाओं पूरा किया, जबकि शिक्षण सहायक सभी पूर्ववर्ती कदम प्रदर्शन किया. यदि यह करने के लिए छात्रों के प्रदर्शन कक्षा में इच्छा है पसंद है, प्रोटोकॉल कि कई प्रयोगशाला सत्रों में किया जा सकता है, वर्ग की समय सीमा पर निर्भर करता है सब यूनिटों में विभाजित किया जा सकता है. यदि यह संभव के लिए छात्रों को पूरे प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए, क्योंकि यह यहाँ था प्रयोगशाला बैठक केवल एक बार एक सप्ताह के लिए कारण नहीं है, छात्रों के वर्ग की शुरुआत में धुंधला समाधान जोड़ सकते हैं और इस्तेमाल किया riboprobe के आधार पर कर सकते हैं, धुंधला पूरा एक घंटे के भीतर. समय यह दाग को विकसित करने के लिए लेता है प्रत्येक riboprobe और प्रयोगात्मक शर्तों की एक किस्म के साथ बहुत भिन्न होता है, और कक्षा से पहले पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए. विशेष रूप से, अगर छात्रों को केवल प्रयोगशाला में दाग से विकसित किया जाएगा, प्रशिक्षकों सभी पूर्ववर्ती कदम है, जो महत्वपूर्ण है और कक्षा के बाहर समय और प्रयास की आवश्यकता होगी के लिए जिम्मेदार हो जाएगा. अगर वांछित, एक छोटी इच्छा वैकल्पिक immunohistochemistry हो सकता है, एंटीबॉडी लेबल का उपयोग करने के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण कल्पना कर सकता है, लेकिन इस समय, zebrafish विकासात्मक जीनों के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी आसानी से उपलब्ध नहीं हैं. एक अन्य विकल्प विभिन्न हड्डीवाला प्रजातियों पर इच्छा का प्रदर्शन होगाएन डी है छात्रों को विभिन्न जीवों में एक ही जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न की तुलना (Pizard एट अल, 2004; Aramaki एट अल, 2007; उभरते मॉडल जीवों, 2008, 2010 उभरते मॉडल जीवों ).
का उपयोग करने का व्यापक लक्ष्य इच्छा एक तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम में छात्रों कैसे आणविक जैविक तकनीकों के लिए संरचनात्मक विकास का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है प्रदर्शित करने के लिए किया गया था. यह भी छात्रों के लिए एक अवसर के लिए कैसे बदल जीन अभिव्यक्ति न केवल विकास विरूपताओं भी लेकिन विकासवादी बदलने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में अटकलें प्रदान की है. विकासवादी विकास जीव विज्ञान (अक्सर के रूप में "evo देवो" निर्दिष्ट) के रूप में औपचारिक रूप दिया है, अध्ययन के इस तेजी से बढ़ते क्षेत्र के विकास के माध्यम से जीनोटाइप और phenotype के लिंक, और विकासवादी परिवर्तन के संभावित यंत्रवत अड्डों स्पष्ट करना है. इस क्षेत्र की वृद्धि के साथ, अधिक ecologists, organismal जीव, और physiologists अपने अनुसंधान में आणविक तकनीक काम कर रहे हैं. हम तर्क है कि एक तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम में इच्छा का उपयोग पाठ्यक्रम को बनाए रखने के अनुसंधान के क्षेत्र में वर्तमान तकनीकी और वैचारिक अग्रिमों के साथ दिनांक, और जैविक उपक्षेत्रों के संयोजन के द्वारा एक बेहतर ऊपरी स्तर जीव विज्ञान कोर्स का क्षैतिज संरेखण की सुविधा में मदद मिलेगी. इसके अलावा, इस एकीकृत दृष्टिकोण के छात्रों के एक पाठ्यक्रम में जैविक अनुसंधान तकनीकों का एक वर्गीकरण जानने का अवसर प्रदान होगा, एक और अधिक विविध शिक्षा और भविष्य अंतःविषय वैज्ञानिक अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए अग्रणी.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों सिरैक्यूज़ विश्वविद्यालय और डॉ. मर्लिन केर में तुलनात्मक हड्डीवाला जीवविज्ञान पाठ्यक्रम के प्रशासन में उनकी भूमिकाओं के लिए जीवविज्ञान विभाग को स्वीकार करना होगा. एलबर्टसन प्रयोगशाला अनुदान R21DE019223 द्वारा दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च के स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने पर स्वास्थ्य / राष्ट्रीय संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान R01AG031922 से समर्थित है.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps) | Fisher | 2300000 | ||
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium | Invitrogen | C404003 | ||
| LB Agar | Fisher | BP1425-500 | ||
| LB Broth | Fisher | BP1426-500 | ||
| Ampicillin Sodium Salt | Fisher | BP1760-5 | ||
| Isopropanol | Acros | 42383-0010 | ||
| Petri Dish 100 x 20 mm non treated | Laboratory Products Sales | 430591 | ||
| 14 ml Culture Tube, Snap Top | Fisher | 1495911B | ||
| Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA | New England Bio Labs | varies | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml | Sigma | D5758-25mL | ||
| Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g | Fisher | s608500 | ||
| Gal 200 proof Ethyl alcohol | Fisher | 04-355-451 | ||
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L | Fisher | bp13321 | ||
| Agarose Low EEO 100 g | Fisher | BP160-100 | ||
| Ethidium Bromide 10 ml | Sigma | 45-E1510 | ||
| Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose | Fisher | BP655-1 | ||
| 1 kb Full Scale DNA Ladder | Fisher | BP2582200 | ||
| DIG RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | ||
| T3 RNA Polymerase | Roche | 1031163 | ||
| T7 RNA Polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| SP6 RNA Polymerase | Roche | 810274 | ||
| Protector Rnase Inhibitor | Roche | 3335399001 | ||
| Dnase I, Rnase Free 10,000 units | Roche | 4716728001 | ||
| EDTA molecular biology reagent | Sigma | e5134-500G | ||
| Lithium Chloride 100 g | Fisher | L121100 | ||
| Sodium Carbonate 1 kg | Fisher | BP357-1 | ||
| Sodium Bicarbonate, 500 g | Fisher | BP328-500 | ||
| Acetic Acid glacial ACS 500 ml | Fisher | a38500 | ||
| Paraformaldehyde R 500 g | Fisher | o4042500 | ||
| PBS Phosphate Buffer Saline 10X | Fisher | bp3991 | ||
| Tween 20 500 ml | Fisher | bp337500 | ||
| Methanol 5 L | Fisher | A4124 | ||
| Proteinase K 50 mg | Fisher | bp170050 | ||
| Formamide 1 L | Fisher | F841 | ||
| 20x SSC 1 L | Fisher | bp13251 | ||
| Citric Acid Anhydrous ACS 500 g | Fisher | a940500 | ||
| Ribonucleic acid transfer type V | Sigma | r7876-2.5KU | ||
| Heparin Sodium salt 50 mg | Fisher | bp252450 | ||
| Maleic acid R 500 g | Fisher | o3417500 | ||
| Sodium Chloride 500 g | Fisher | s271500 | ||
| Sodium Hydroxide 500 g | Fisher | s318500 | ||
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | ||
| Lamb Serum 500 ml | Invitrogen | 16070096 | ||
| Anti DIG AP fragments | Roche | 11093274910 | ||
| 2M Tris Solution 500 ml | Fisher | bp1759500 | ||
| Magnesium Chloride 500 g | Fisher | m33500 | ||
| BCIP 3 ml | Roche | 11383221001 | ||
| NBT 3 ml | Roche | 11383213001 | ||
| Glycerol 99% 2.5 L | Fisher | AC158920025 | ||
| Plate 12 well PS ST w/Lid | VWR | 62406-165 | ||
| Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262861 | ||
| Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs | Laboratory Products Sales | L262890 | ||
| 1.6 ml microfuge tube | Laboratory Products Sales | L234401 | ||
| 2 Parafilm 2″ x 250 ft | Fisher | s37441 | ||
| Transfer Pipet 7 ml | USA Scientific | 1020-2520 | ||
| .1-10 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific | 1111-3000 | ||
| 1-200 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific | 1111-0006 | ||
| 101-1000 μl Pipet Tip, Bulk | USA Scientific | 1111-2021 | ||
| Aluminum Foil | Grocery Store |
- Autoclave
- Micro-centrifuge
- 37°C incubator (with shaker)
- 4°C micro-centrifuge
- Water bath
- Vortex
- Gel electrophoresis apparatus
- -20°C freezer
- -80°C freezer
- Rocker/shaker
- 4°C refrigerator
- Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)
Riferimenti
- Albertson, R. C., Yelick, P. C. Roles for fgf8 signaling in left-right patterning of the visceral organs and craniofacial skeleton. Dev. Biol. 283, 310-321 (2005).
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