Dissection et la coloration des Drosophile Ovaires larvaires
Summary
Comment les niches et les cellules souches forment pendant le développement est une question importante avec des implications pratiques. Dans le<em> Drosophile</emL'ovaire>, les cellules germinales souches et leurs niches somatiques se forment pendant le développement larvaire. Cette vidéo montre comment disséquer, aux taches et monter les gonades femelles de la fin du troisième stade larvaire (LL3)<em> Drosophile</emLarves>.
Abstract
De nombreux organes dépendent de cellules souches pour leur développement au cours de l'embryogenèse et pour l'entretien ou la réparation pendant la vie adulte. Comprendre comment les cellules souches forme, et comment ils interagissent avec leur environnement est donc crucial pour comprendre le développement, l'homéostasie et la maladie. L'ovaire de la mouche des fruits Drosophila melanogaster a servi de modèle influent pour l'interaction des cellules germinales souches (CSS) avec leurs cellules de soutien somatiques (de niche) 1, 2. L'endroit connu de la niche et le CSS, couplée à la capacité de les manipuler génétiquement, a permis aux chercheurs d'élucider une variété d'interactions entre cellules souches et leurs niches 3-12.
Malgré la richesse de l'information sur l'entretien des mécanismes de contrôle de la CGC et de la différenciation, on sait relativement peu sur la façon dont les CSS et leurs niches somatiques forment pendant le développement. Environ 18 créneaux somatiques, dont les filaments cellulaires comprennent des composants du terminal et cellules de la coiffe (Figure 1), la forme au cours du troisième stade larvaire 13-17. CSS proviennent des cellules germinales primordiales (PGC). PGC prolifèrent au premiers stades larvaires, mais après la formation de la niche un sous-groupe de PGC devient CSS 7, 16, 18, 19. Ensemble, les cellules somatiques de niche et les CSS font une unité fonctionnelle qui produit des oeufs durant toute la vie de l'organisme.
Beaucoup de questions concernant la formation de l'unité de la CGC restent sans réponse. Des procédés tels que la coordination entre les cellules précurseurs des niches et des précurseurs de cellules souches, ou la génération de l'asymétrie dans les PGC à mesure qu'ils deviennent les CSS, peut être mieux étudié dans la larve. Cependant, une étude méthodique de développement de l'ovaire larvaire est difficile physiquement. Premièrement, les ovaires des larves sont petites. Même à la fin de stades larvaires, ils ne sont que 100 microns de diamètre. En outre, les ovaires sont transparentes et sont intégrés dans un corps blanc de graisse. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour isoler les ovaires de la fin du troisième stade larvaire (LL3) larves de drosophile, suivie d'une coloration avec des anticorps fluorescents. Nous offrons des solutions techniques aux problèmes tels que la localisation des ovaires, la coloration et le lavage des tissus qui ne coulent pas, et faire en sorte que les anticorps pénètrent dans les tissus. Ce protocole peut être appliqué à des stades antérieurs de larves et de testicules larvaires ainsi.
Protocol
Discussion
Cette vidéo montre un isolement et de protocole de coloration des ovaires fin du troisième stade larvaire. Pour effectuer ce protocole régulièrement et de manière fiable, une attention devrait être accordée aux points suivants:
- Pour les larves synchronisée et bien développé, le surpeuplement doit être évitée.
- Pour éviter la perte des ovaires petits translucides, assurez-vous de disséquer le corps gras intacte. Cela aidera également à localiser les ovaires au stade de montage, en p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IM est soutenu par la Marie Curie réintégration subvention. Ce travail a été soutenu par le Fonds ne Israel Science Grant. 1146-1108, par le Helen et Martin Kimmel Institut de recherche de cellules souches à l'Institut Weizmann des Sciences et de la Fondation de bienfaisance Leir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
Riferimenti
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