Dissecção e coloração de Drosophila Larval Ovários
Summary
Como nichos e células-tronco se formam durante o desenvolvimento é uma questão importante com implicações práticas. No<em> Drosophila</em> Ovário, células-tronco germinativas e somáticas nichos sua forma durante o desenvolvimento larval. Este vídeo demonstra como dissecar, mancha e montar gônadas femininas do final de terceiro ínstar (LL3)<em> Drosophila</emLarvas>.
Abstract
Muitos órgãos depende de células-tronco para o seu desenvolvimento durante a embriogênese e para a manutenção ou reparação durante a vida adulta. Compreensão de como as células-tronco forma, e como eles interagem com seu ambiente é crucial para a compreensão da homeostase, desenvolvimento e doença. O ovário da mosca da fruta Drosophila melanogaster tem servido como um modelo influente para a interação de células-tronco germinativas (GSCS) com suas células somáticas de apoio (nicho) 1, 2. O local conhecido do nicho e as GSCS, aliada à capacidade de manipular geneticamente eles, tem permitido aos pesquisadores elucidar uma série de interações entre células-tronco e seus nichos 3-12.
Apesar da riqueza de informações sobre mecanismos de controle de manutenção GSC e diferenciação, relativamente pouco se sabe sobre como GSCS e seus nichos de forma somática durante o desenvolvimento. Cerca de 18 nichos somáticas, cujos componentes incluem celulares filamento terminal e as células da tampa (Figura 1), formam-se durante o terceiro instar larval 13-17. GSCS originam de células germinativas primordiais (PGCs). PGCs proliferam no início fases de larva, mas após a formação do nicho um subgrupo de PGCs torna-se GSCS 7, 16, 18, 19. Juntas, as células somáticas e de nicho a GSCS fazer uma unidade funcional que produz ovos durante toda a vida do organismo.
Muitas perguntas sobre a formação da unidade GSC permanecem sem resposta. Processos tais como a coordenação entre as células precursoras de nichos e de precursores de células-tronco, ou a geração de assimetria dentro PGCs como eles se tornam GSCS, pode ser melhor estudados na larva. No entanto, um estudo metódico do desenvolvimento larval ovário é fisicamente desafiador. Primeira, os ovários das larvas são pequenas. Mesmo em final de estágios larvais são apenas 100μm de diâmetro. Além disso, os ovários são transparentes e estão embutidos em um corpo de gordura branca. Aqui nós descrevemos um protocolo passo a passo para isolar ovários de final do terceiro instar as larvas Drosophila (LL3), seguido por coloração com anticorpos fluorescentes. Nós oferecemos algumas soluções técnicas para problemas como a localização dos ovários, coloração e lavagem de tecidos que não afundam, e certificando-se que os anticorpos penetrar no tecido. Este protocolo pode ser aplicado a fases anteriores larval e testículos larval também.
Protocol
Discussion
Este vídeo demonstra um isolamento e protocolo de coloração da final do terceiro instar larval ovários. Para executar este protocolo rotineiramente e de forma confiável, a atenção deve ser dada aos seguintes pontos:
- Para as larvas sincronizados e bem desenvolvida, a superlotação deve ser evitada.
- Para evitar a perda dos ovários pequenos translúcido, certifique-se de dissecar a gordura corporal intacta. Isso também irá ajudar a localizar os ovários na fase de montagem, particularmente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IM é apoiado pela Marie Curie conceder re-integração. Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Ciência Israel não Grant. 1146-1108, pelo e Helen Kimmel Martin Institute for Stem Cell Research no Instituto Weizmann de Ciência ea Fundação Charitable Leir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | J.T.Baker | |||
| Kcl | Merck | |||
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| MgCl2 | Merck | |||
| Sucrose | J.T.Baker | |||
| Hepes | Sigma-Aldrich | |||
| PBS | Sigma-Aldrich | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
| Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
| Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
| Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
| s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
| 9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
| Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
| 6 well plates | Costar | 3516 | ||
| Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
| Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
| Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
| Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
| 1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
| Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
| Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
| Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
| Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |
Riferimenti
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