Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Summary

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Abstract

Doğal öldürücü (NK) hücreleri, bağışıklık gözetim çeşitli bulaşıcı mikroorganizmaların ve tümörleri karşı önemli bir rol oynamaktadır. NK hücreleri ve in vitro genişletmek için yeteneği sınırlı kullanılabilirlik NK hücre immünoterapi gelişimi kısıtladı. Burada fonksiyonel NK hücrelerinin ex vivo olarak, membrana bağlı IL21 ifade K562 hücreleri kullanarak yapay bir antijen sunan hücre (aAPC) büyük miktarlarda verimli bir şekilde genişletmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

NK hücre bugüne kadar evlatlık tedaviler, T hücreleri veya NK hücreleri pozitif seçimi tükenmesi takip donör kararlı durum leukapheresis hücre elde edilen bir ürün kullanmış olurlar. Genellikle ürün gecede IL-2 aktive ve sonra ertesi gün ¹ yönetilmektedir. Çünkü NK hücreleri periferik kan düşük frekanslı, NK hücreleri nispeten az sayıda klinik çalışmalarda teslim edilmiştir.

NK hücreleri in vitro yaymak için yetersizlik, en iyi klinik sonuç için yeterli hücre sayıları üretmek için sınırlayıcı bir faktör olmuştur . NK hücreleri bazı genişleme (1-2 hafta içinde 5-10 kat), yüksek doz IL-2 ^sadece 2 ile sağlanabilir . Otolog T hücrelerinin aktivasyonu da muhtemelen yerel sitokin ³ sürümü ile, NK hücre genişleme arabuluculuk yapabilirsiniz. Mezenkimal stroma veya yapay antijen sunan hücreler (aAPCs) desteği, hem de periferik kan ve kordon ^kanı 4 NK hücrelerinin büyümesini desteklemek . Kombine NKp46 ve antikor kaplı boncuklar CD2 aktivasyon henüz 21 gün içerisinde yaklaşık 100 kat genişleme, NK hücre genişleme (Miltenyi Biotec, Auburn CA) için pazarlanmaktadır.

NK hücreleri aAPC genişletilebilir veya-aktive kullanarak klinik denemeleri devam etmekte, önemli bir genişleme olmadan lösemik hücre hattı CTV-1 – Başbakan ve aktive ^NK hücreleri 5 kullanarak bir. 21 gün ⁶ ortalama 490 kat genişleme sağlanması, NK hücre genişlemesi için ikinci bir deneme EBV-LCL kullanır. Üçüncü bir K562 tabanlı aAPC 21 gün içerisinde 277 kat ortalama NK genişleme elde 4-1BBL (CD137L) ve membrana bağlı IL-15 (MIL-15) ^7, transduced kullanır. NK hücreleri, K562-41BBL-mIL15 kullanarak genişletilmiş olmasına rağmen, aAPC in vitro ve in vivo yorumlanmamış NK hücrelerine kıyasla son derece sitotoksik, ve ADCC katılmak, onların çoğalması yaşlanması ^telomer kısalması 8 atfedilen ile sınırlıdır. Daha yakın bir zamanda 350 kat genişleme NK hücreleri K562 ifade MİKA, 4-1BBL ve IL15 ⁹ kullanarak bildirildi.

NK hücre genişleme yöntemi, burada 21 günde bir ortalama 21.000 kat genişleme sağlanması yaşlanması olmadan, NK hücreleri hızla çoğalması üreten nitelendirdi.

Protocol

1. Buffy Coat PBMC'ler izolasyonu Periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) leukapheresis tarafından elde edilen sağlıklı donör buffy coat örnekleri Ficoll-Paque batmaz yoğunluğu santrifüj ile elde edilir. Ficoll Paque santrifüj başına çok küçük değişiklikler yaparak üreticinin protokolü olarak yapılır. Son hacim 140 mL (tipik buffy coat hacmi 40-70 ml) bir kan bankası buffy coat normal bir donör PBS ekle. Katman buffy coat örnek 35 ml Ficoll-Paque (4 tüpler) 15 ml. Frensiz 20 dakika 400g santrifüjleyin. Ficoll-Paque PBMC'ler Kurtar: plazma arayüzü, Ficoll-Paque altındaki eritrositlerde atmayın. PBMC'ler 400g her zaman 10 dakika boyunca santrifüj, PBS ile üç kez yıkayın. PBMC'ler RosetteSep tarafından izole edilebilir (Bölüm 4) bu aşamada NK hücre genişlemesi veya NK hücreleri için doğrudan kullanılmamalıdır. Kalan PBMC'ler sıvı nitrojen içinde% 10 DMSO içeren FBS donmuş olabilir. Ficoll aspire ve iki adet 50 ml santrifüj tüpüne adım 5 kırmızı kan hücreleri toplamak, (50 ml işareti eklendi) PBS ile üç defa yıkamak, her defasında RBC tabakasının üst granülositler kaldırmak için supernatant kaymağını aspirat. Eritrositlerde hemen NK hücreleri RosetteSep  arıtma (bakınız Bölüm 4) için kullanılan ya da 4 Alsever çözümü eşit hacmi saklanabilir ° C (eritrositler daha sonra kullanmak üzere en fazla 4 hafta bir mağaza olabilir). 2. NK hücre genişletme NK hücre genişleme PBMC'ler kullanarak veya NK hücreleri saflaştırılmış başlatılabilir. Genişlemesi için kullanılan PBMC'ler miktarı, üç hafta genişleme sonunda istenen NK hücreleri miktarına göre değişik olabilir, ayrıntılı bilgi için temsilcisi sonuç bölümüne bakın. (Bkz. Not 1) UYARIM 1 Gün 0 Genişletilecek her 5×10 6 PBMC'ler için, sayım ve 100 Gy gama ışınlama kullanılarak 10×10 6 K562 CL9 mIL21 ışın tedavisi. Mesaj ışınlama hücreleri, NK hücre genişlemesi medya (NKEM) PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın. 10×10 6 ışınlanmış K562 CL9 T75 balonuna 40 ml NKEM mIL21 (1:2 oranı) ve 37 ° dik bir kuluçka yerleştirin ° C ve% 5 CO 2 ile Tohum 5×10 6 PBMC'ler Gün 3 ve 5 400g az 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri kurtarır ve taze NKEM medya yarısını yerine (tüm medya hacmi için taze IL2 ekleyerek) ve kültür devam ediyor. UYARIM 2 7. Gün Bir hafta sonunda kültür hücrelerinin sayısını sayın. Flow sitometri fenotipleme için 5×10 5 hücre (Not 2) bir kenara Restimulated her 5×10 6 hücre için, sayım ve 100 Gy gama ışınlama kullanarak 5×10 6 K562 CL9 mIL21 ışın tedavisi. (Bkz. Not 3), 2.5×10 5 toplam hücre / ml NKEM ışınlanmış K562 CL9 mIL21 (1:1 oranı) ve tekrar süspansiyon eşit sayıda ekleyin . T75 şişeler tohum hücreleri (şişeyi başına maksimum 50 ml). 10 ve 12 Gün Hücre sayısını. (Not 3), hücre sayıları dayalı taze NKEM ile tüm medya değiştirin. 14. Gün Genişleme iki hafta sonunda kültür hücrelerin sayısını. Flow sitometri fenotipleme için 5×10 5 hücre (Not 2) bir kenara NK hücreleri, genişleme PBMC'ler başladı genişleme RosetteSep arıtma protokolü (bakınız Bölüm IV) kullanarak bu aşamada arındırılmalıdır. Stimülasyon 3 geçin NK hücreleri saflaştırılmış genişleme başladı. NK hücreleri (Adım 8) saflığını doğrulamak için flow sitometri fenotipleme için arıtma kenara 5×10 5 hücre ayarladıktan sonra. Uyarım 3 arıtılmış NK hücreleri (Not 4) ile devam edin. UYARIM 3 NK hücreleri, hücre sayıları dayalı NKEM ışınlanmış K562 CL9 mIL21 (1:1 oranı) (Not 3) ile yeniden süspanse. 17 ve 19 Gün Hücre sayısını. (Not 3) hücre sayıları dayalı taze NKEM ortam değiştirin. 21. gün Genişleme üç hafta sonunda kültür hücrelerin sayısını. Recover tam NK hücre fenotipleme antikor panel için flow sitometri analizi için 1×10 6 hücre (Bakınız Tablo 1). Ileride kullanmak üzere flakon başına 5×10 7 hücre maksimum yoğunluğu% 10 DMSO içeren FBS hücrelerin dondurun. 3. NK Hücre Sitotoksisite Testi NKEM NK hücreleri ve tohum bir flakon, pe önce bir gün Çözülmekurtarma izin sitotoksisite testinde rforming. (Not 5) tek bir hedef hücre hattı, 6×10 5. NK hücreleri ve 3×10 5 hedef hücreleri kullanarak her NK hücre sitotoksisite testi için gereklidir. NKEM Calcein-AM (1 DMSO mg / ml stok) (Not 6) seyreltilmesi CAM-Media hazırlayın. (Bakınız Not 7) CAM-medya 1 ml 10 6 hedef hücreleri tekrar Arada sırada sallayarak, 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Yeniden süspanse NK, 1×10 6 hücre / mL hücre ve NK hücre süspansiyonu her bir U-bottom 3 kuyu 200uL eklemek 96-plaka ilgili to10: 1 D: Şekil 1'de gösterildiği gibi T oranı . (Not 8) "Maksimum" dışında kalan tüm kuyular tam bir medya 100uL ekleyin. "Maksimum" 100uL 2% Triton X-100 ekleyin. 5 sonraki E NK hücreleri seri dilüsyonları yapın: her seferinde hücre 100uL aktararak T oranları, iyice karıştırın. Son kuyuları (0.3125:1, T oranı E) 100uL atın. Calcein yükleme 1 saat sonra, 1200 rpm'de 5 dakika için santrifüj, iki kez NKEM hedef hücreleri yıkayın. (Not 9) 1×10 5 hücre / mL hedef hücreleri ve tekrar süspansiyon yeniden saymak. (1×10 4 / iyi) her bir kuyu için hedef hücrelerin 100 mcL ekleyin. Hücre temas başlatmak için 100g az 1 dakika boyunca santrifüjleyin. 37 ° ° C'de ve% 5 CO 2 4 saat. Kültür düzgün yayımlanan Calcein askıya için 100 mcL pipetter pipetleme hafifçe karıştırın, pelet hücreleri 5 dakika 100g plaka aşağı spin ve kabarcıkları önlemek için özen yeni bir plaka süpernatantı 100 mcL transfer. Ince bir iğne kullanarak formu herhangi bir kabarcıklar pop. Floresan plaka okuyucu (eksitasyon filtresi 485 nm, emisyon filtresi 530 nm) kullanarak plaka okuyun. Alt okumanız önerilir. X 100 – [/ (test sürüm spontan sürümü) (kendiliğinden serbest maksimum sürüm)] formülü göre hesaplayın Yüzde Özel Lizis. 4. RosetteSep tarafından NK Hücre Arıtma (RBC: PBMC 100:1) 50 ml tüp içine PBMC veya genişletilmiş hücreleri ile eritrositlerde 100 kat daha fazla alın. Kullanarak taze eritrosit doğrudan bir sonraki adıma devam edin veya 1200 rpm santrifüj, eritrositlerde Alsever s çözümü saklanır olsaydı sayıda eritrosit sayımı ve PBS ile üç kez% 2 FBS ile takviye eritrosit miktarı (100 kat daha fazla) uygun yıkama 10 dakika her zaman için. Adım 1.7 veya PBS içinde adım 2.10 genişletilmiş hücreleri PBMC'ler ile eritrositlerde birleştirin +% 2 FBS nihai hacmi PBMC'ler veya genişletilmiş hücreleri 5×10 7 kişi başına 1 ml . RosetteSep, 1μL PBMC'ler veya genişletilmiş hücreleri 1×10 6 kişi başına  İnsan NK Hücre Zenginleştirme Kokteyl ekleyin . İyice karıştırın ve her 5 dakikada bir karıştırarak yumuşak 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. PBS +% 2 FBS karışımı hafifçe eşit hacim ve Ficoll-Paque üst katman ekleyin. (Bölüm I) hücre izolasyonu için açıklanan Ficoll Paque santrifüj adımları tekrarlayın. Arıtma sonra kurtarıldı NK hücreleri saymak 5×105 hücreleri ve NK hücre saflık (Adım 8) flow sitometri ile phenotpying için bir kenara koyun. 5. Notlar NOT 1 PBMC'ler gelen NK hücreleri doğrudan genişletilmiş veya RosetteSep  saflaştırılmış NK hücreleri olabilir. Biz benzer bir genişleme verimliliği kaydetti var, ama bazı bağışçılar genişleme önce RosetteSep zorluk arındırıcı çok düşük NK hücre sayıları olabilir. NOT 2: Biz rutin olarak, NK hücreleri, CD3-negatif ve CD16 veya CD56-pozitif olduğu gibi numaralandırma, genişleme sırasında fenotipleme CD56-FITC, CD16-PE, ve CD3-PE- Cy5 kullanabilirsiniz. NOT 3, her ortam değişikliği veya stimülasyon az 2.5 x 10 5 / ml pik genişleme aşamalarında tekrar süspansiyon hücreleri, NK / mL başına ya da 2 milyonun altında PBMC hücre sayıları tutmak için . Bu besinlerin tükenmesi önlemek ve maksimum genişleme ve hayatta kalma elde etmenize yardımcı olacaktır. NOT 4 NK genişleme oranı uyarılara 1 ya da 2 yarı donmuş hücreleri sonunda donör bağımlı ve yarı deneysel ihtiyaç bağlı olarak daha da genişletilmiştir. Biz daha sonra açılımları için donmuş hücreleri kullanarak iyi bir başarı elde ettiler. NOT 5 700 uls NKEM ve sitotoksisite testinde kurmak için NKEM 4 mL yeniden süspanse 4×10 5 Calcein-AM lekeli hedef hücreleri yeniden süspanse 7×10 5 NK hücreleri en az kullanmanızı öneririz hata oda izin için. Eğer hedef hücreler hücreleri yüksek hacimli (6×10 5 ila 6 ml) kullanılan medya havzasının büyüklüğüne göre gerekli olabilir tohumlama için çok kanallı pipet kullanarak. Ayrıca tavsiye edilen NK hücre sayıları, özellikle E: T oranları yüksek E kullanmak için, protokol gösterir: T oranları artırmakbuna göre ml başına NK hücre sayıları (40:1 D için örneğin: T oranı kullanım 4×10 6 hücre / ml) 6 NOT: 1:500, 1:400, aşağıdaki dilüsyonları kullanarak tercih hedef hücre hattı için bir ön Calcein-AM yükleme titrasyon yapmak öneririz. 1:300, 1:200 ve 1:100, maksimum ve spontan sürüm arasındaki optimum bir fark elde etmek. NOT 7, ilk hedef olarak yapışık bir hücre hattı kullanarak enzimatik olmayan hücre disosiasyon tampon kullanarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak. CAM-medya ADCC performans varsa, hedef hücreleri yinelenen bir tüp hazırlayın. NOT 8 ADCC performans varsa, aynı NK hücreleri 10:01 e karşılık gelen 3 kuyu ekleyin: T ADCC . Ek donörler için tekrarlayın. Ek hedef hücreler için tekrarlayın. NOT 9 ADCC bir deneyi gerçekleştirmek, Calcein yükleme 45 dakika sonra, hedef hücreleri karşı ADCC inducing için spesifik antikor 10ug ekleyin. 15 dakika daha sonra, 1200 rpm'de 5 dakika için santrifüj iki kez tam bir ortamda hedef hücreleri yıkayın. 1×10 5 hücre / mL yeniden süspanse hücre ve protokolde bir sonraki adıma devam edin . 6. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR Şekil 2 genişleme düzeni başına yapıldığında, başlangıç ​​materyali, 1×10 9 10 10 hücreleri (donör bağlı değişkenlik) tipik NK hücre verimleri aralığı 5×106 PBMC'ler kullanarak, yukarıda anlatılan. Şekil NK hücre kat genişleme gösterir (n = 19), orijinal ürün bulunan NK hücreleri ile karşılaştırıldığında (medyan + / – dörtte). Şekil 3 genişletilmiş NK hücreleri, birkaç istisna dışında (CD11b, CD160 ve CD244) ile yorumlanmamış birincil NK hücreleri ile karşılaştırılabilir çeşitli NK hücre reseptörleri ifade . Şekil 4 PBMC'ler kurtarma Buffy coat bağımlı donör ve 300×10 6 800×10 6 uzanabilir. PBMC% 18 -% 2 NK hücreleri oluşur. Genişletilmiş hücrelerinin RosetteSep arıtma için,% 40-70 gün saf NK hücreleri 14 aralıkları kurtarma. Genişleme ve saflaştırma önerilen protokol takip ederek,% 99 NK hücre saflığı beklenebilir. Şekil 5. Genişletilmiş NK hücreleri tümör hücre hatlarının nöroblastom, AML, osteosarkom ve melanom (temsilcisi AML öldürme yüzde lizis olarak gösterilen) de dahil olmak üzere bir dizi karşı sitotoksisite göstermiştir.

Materials

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

• 90% RPMI 1640 (Cellgro)
• 10% Fetal Bovine Serum (Gibco)
• 1x Penicillin / Streptomycin (Cellgro)
• 1x L-Glutamine (Gibco)
  • Filter Sterilize media before use.
• 50 U/ mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)
  • – Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.

PBMC and NK Cell Isolation

• Ficoll-Paque (GE Healthcare)
• Alsever’s solution (Sigma)
• RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies)

NK Cell Cytotoxicity Assay

• Calcein-AM (Invitrogen)
  • Stock solution is at 1mg/ mL, store frozen in 50 μL aliquots. Dissolve in NKEM media to achieve desired dilution for cell staining.

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below;

	Antibody	Volume per Test	Company	Catalog number
Tube 1	Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tube 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2/3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R&D Systems Miltenyi Biotec R&D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tube 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tube 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tube 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42