Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Summary

Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir e purificar um grande número de células NK e avaliar a sua função.

Abstract

Natural killer (NK) desempenham um papel importante na vigilância imune contra uma variedade de microorganismos infecciosos e tumores. Disponibilidade limitada de células NK e capacidade de expansão in vitro restringiu o desenvolvimento de NK imunoterapia celular. Aqui nós descrevemos um método eficiente para expandir a vastas quantidades de funcional NK ex vivo células usando células que expressam K562 ligada à membrana IL21, como uma célula apresentadora de antígeno artificial (AAPC).

Terapias com células NK adotivos até à data têm utilizado um produto de células obtidas por steady-state leucaférese do doador seguida pela depleção de células T ou seleção positiva de células NK. O produto é geralmente activado no IL-2 durante a noite e então administrado no dia seguinte ^1. Devido à baixa freqüência de células NK no sangue periférico, um número relativamente pequeno de células NK foram entregues nos ensaios clínicos.

A incapacidade para propagar células NK in vitro tem sido o fator limitante para a geração de números de celular suficiente para um resultado clínico favorável. Alguma expansão das células NK (10/05 vezes ao longo de 1-2 semanas) tem ser alcançado através de altas doses de IL-2 sozinho ^2. Ativação de células T autólogas podem mediar a expansão das células NK, presumivelmente, também através da liberação de citocinas local ^3. Suporte com estroma mesenquimal ou células antígeno apresentando artificial (aAPCs) pode apoiar a expansão das células NK, tanto sangue periférico e sangue do cordão ^4. NKp46 combinado e CD2 ativação por anticorpos revestido contas é atualmente comercializado para expansão de células NK (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resultando em expansão de cerca de 100 vezes em 21 dias.

Ensaios clínicos utilizando AAPC-expandido ou ativadas as células NK estão em curso, uma utilizando a linha de células leucêmicas CTV-1 para o principal e ativar as células NK ^5, sem expansão significativa. Um segundo julgamento utiliza EBV-LCL para expansão de células NK, atingindo uma média de expansão 490 vezes em 21 dias ^6. A terceira utiliza uma AAPC K562 baseado transduzidas com 4-1BBL (CD137L) e ligada à membrana IL-15 (MIL-15) ^7, que alcançou uma média de expansão NK 277 vezes em 21 dias. Embora, as células NK expandida usando K562-41BBL-mIL15 AAPC são altamente citotóxica in vitro e in vivo em comparação com unexpanded células NK, e participar no ADCC, sua proliferação é limitada pela senescência encurtamento dos telômeros atribuída a ^8. Mais recentemente, uma expansão de 350 vezes das células NK foi relatado usando K562 MICA expressar, 4-1BBL e IL15 ^9.

Nosso método de expansão de células NK aqui descritos produz rápida proliferação das células NK, sem senescência alcançar uma expansão média 21 mil vezes em 21 dias.

Protocol

1. Isolamento de PBMCs de Buffy Brasão Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são obtidos por centrifugação de empuxo sobre densidade Ficoll-Paque de doadores saudáveis ​​amostras obtidas por buffy coat leucaférese. A centrifugação Ficoll-Paque é feito como protocolo por fabricante, com pequenas modificações. Adicionar PBS a um doador de sangue normal-bancárias buffy coat para um volume final de 140 mL (volume casaco típico buffy é 40-70 mL). Camada de 35 mL de amostra buffy coat, em 15 mL de Ficoll-Paque (4 tubos). Centrifugar a 400 g por 20 minutos sem freio. Recuperar o PBMCs do Ficoll-Paque: interface plasma, não descartam a hemácias no fundo do Ficoll-Paque. Lavar PBMCs três vezes com PBS, centrifugação cada vez menos 400g por 10 minutos. PBMCs podem ser usados ​​diretamente para a expansão das células NK, nesta fase, ou células NK pode ser isolado por RosetteSep (Seção 4) PBMCs restantes podem ser congelados em FBS contendo DMSO 10% em nitrogênio líquido. Aspirar o Ficoll e recolher os glóbulos vermelhos a partir do passo 5 em duas tubo de centrífuga de 50 mL, lavar três vezes com PBS (adicionado a 50 mL marca), cada vez aspirar o sobrenadante desnatação do topo da camada de RBC para remover granulócitos. Os glóbulos vermelhos podem ser utilizados imediatamente para RosetteSep  purificação das células NK (consulte a Seção 4) ou armazenado em volume igual de solução Alsever é a 4 ° C para uso posterior (Os glóbulos vermelhos pode ser reservado para um máximo de 4 semanas). 2. NK expansão celular A expansão das células NK pode ser iniciado usando PBMCs ou purificada de células NK. A quantidade de PBMCs usado para a expansão pode ser variado com base na quantidade de células NK desejado no final de uma expansão de três semanas, consulte a secção representativa resultados para obter detalhes. (Ver Nota 1) ESTIMULAÇÃO 1 Dia 0 Para cada 5×10 6 PBMCs ser expandido, contagem e irradiar 10×10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. Pós-irradiação, lavar as células com PBS e ressuspender em células NK expansão media (Nkem). Semente de 5×10 6 PBMCs com 10×10 6 irradiados K562 CL9 mIL21 (1:2) em 40 mL de Nkem em um frasco T75 e colocá-lo na posição vertical em uma incubadora a 37 ° CO C e 5% 2. Dias 3 e 5 Recuperar as células por centrifugação a 400g por 5 min e substituir metade da mídia com Nkem fresco (adicionando IL2 fresco para o volume de mídia inteira) e continuar a cultura. ESTIMULAÇÃO 2 Dia 7 Contar o número de células em cultura no final de uma semana. Separe 5×10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) Para cada 5×10 6 células para ser restimulated, contagem e irradiar 5×10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. Adicionar um número igual de irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) e ressuspender em Nkem em 2.5×10 5 total de células / mL (Ver Nota 3). Células de sementes em frascos T75 (máximo 50 mL por frasco). Dias 10 e 12 Contar o número de células. Mudança de mídia inteira com Nkem fresco com base no número de células (Veja Nota 3). Dia 14 No final de duas semanas de expansão contar o número de células em cultura. Separe 5×10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) Se a expansão foi iniciada a partir de PBMCs as células NK pode ser purificado nesta fase de expansão utilizando o protocolo de purificação RosetteSep (consulte a Seção IV). Se a expansão foi iniciada a partir de células NK purificada proceder à estimulação 3. Após purificação de lado 5×10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo para verificar a pureza das células NK (como no Passo 8). Prosseguir com Estimulação 3 usando todas as células NK purificado (ver Nota 4). ESTIMULAÇÃO 3 Células NK ressuspender com irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) em Nkem com base em números de células (ver nota 3). Dias 17 e 19 Contar o número de células. Mudança de mídia com Nkem fresco com base no número de células (ver nota 3). Dia 21 No final de três semanas de expansão contar o número de células em cultura. Recuperar 1×10 6 células para análise de citometria de fluxo para o pleno NK painel de anticorpos de células fenotipagem (Ver Tabela 1). Congelar células em FBS contendo DMSO 10%, a uma densidade máxima de 5×10 7 células por frasco para uso futuro. 3. NK ensaio de citotoxicidade celular Descongelar um frasco de células NK e sementes em Nkem, um dia antes da performing ensaio de citotoxicidade para permitir a recuperação. Para cada ensaio de células NK citotoxicidade usando uma linha única célula-alvo, 6×10 5 células NK e 3×10 5 células-alvo são exigidos (ver nota 5). Prepare CAM-Media diluindo calceína-AM (estoque 1 mg / mL em DMSO) em Nkem (Ver Nota 6). Ressuspender 10 6 células-alvo em 1 mL de CAM-media (ver nota 7). Incubar por 1 hora a 37 ° C, com agitação ocasional. Células NK ressuspender em 1×10 6 células / mL e adicionar 200uL de suspensão de células NK a cada um dos três poços de um U-bottom 96 poços da placa a 10 correspondentes: 1 razão E: T mostrado na Figura 1. (Ver Nota 8) Adicione 100uL de mídia completo para todos os poços restantes, exceto para "Máximo". Adicione 100uL de 2% Triton X-100 a "máxima". Realizar diluições em série das células NK para a E 5 subseqüentes: relações T, transferindo 100uL de células de cada vez, misture bem. Descartar 100uL dos poços passado (razão E: T de 0.3125:1). Após 1 hora de carregamento calceína, lave as células-alvo em Nkem duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9) Re-contar as células-alvo e ressuspender em 1×10 5 células / mL. Adicionar 100 mL de células-alvo para cada poço (1×10 4 / bem). Centrifugar por 1 min a 100g de iniciar o contato da célula. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 4 horas. Misture delicadamente a cultura por pipetagem com uma pipeta de 100 L, a fim de suspender a uniformemente calceína lançado, spin down placa de 100g por 5 minutos para sedimentar as células e transferir 100 mL do sobrenadante para um novo prato com cuidado para evitar bolhas. Pop as bolhas que se podem formar com agulha fina. Leia a placa usando um leitor de placas fluorescentes (excitação filtro de 485 nm, a emissão de filtro de 530 nm). Leitura de fundo é recomendado. Calcule Lise Percentual específicas de acordo com a fórmula [(versão de testes de liberação espontânea) / (liberação máxima – liberação espontânea)] x 100. 4. NK Purificação celular por RosetteSep Tome de 100 vezes o excesso de glóbulos vermelhos ao de PBMCs ou células expandidas, em um tubo de 50 mL (100:1 RBC: PBMC). Se usar os glóbulos vermelhos frescos prosseguir diretamente para a etapa seguinte ou se a hemácias foram armazenados em solução Alsever s, contar o número de hemácias e de lavagem adequados (100 vezes em excesso) quantidade de hemácias com PBS suplementado com 2% FBS três vezes, centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos a cada vez. Combine com hemácias PBMCs a partir do passo 1.7 ou células expandidas a partir do passo 2,10 em PBS + 2% de SFB para um volume final de 1 mL por 5×10 7 de PBMCs ou células expandidas. Adicionar 1μL de RosetteSep  Human Enrichment Célula NK Cocktail por 1×10 6 de PBMCs ou células expandidas. Misture bem e deixe em temperatura ambiente por 20 minutos, com suave mistura a cada 5 minutos. Adicionar igual volume de PBS + 2% FBS mix suave e camada em cima de Ficoll-Paque. Repita os passos de Ficoll-Paque centrifugação descrita para o isolamento de PBMC (Seção I). Contagem das células NK recuperado após purificação e reserve 5×105 células para phenotpying por citometria de fluxo para NK pureza celular (Passo 8). 5. Notas NOTA 1. Células NK pode ser expandida diretamente de PBMCs, ou de RosetteSep  células purificadas NK. Temos observado a eficiência de expansão semelhante, mas alguns doadores podem ter muito baixo o número de células NK, resultando na purificação dificuldade RosetteSep antes da expansão. NOTA 2. Rotineiramente usamos CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 para fenotipagem durante a expansão, enumerando as células NK como aqueles que são CD3-CD16 negativos e ou CD56-positivo. NOTA 3. A cada troca de mídia ou estimulação, as células ressuspender a 2,5 x 10 5 mL / para manter os números PBMC / NK de células iguais ou abaixo de 2 milhões por mL em estágios de pico de expansão. Isto irá prevenir a depleção de nutrientes e ajudar a alcançar a expansão máxima e sobrevivência. NOTA 4. A taxa de expansão NK é doador dependentes e no final de estímulos 1 ou 2 parte das células pode ser congelada e parte ampliada ainda mais, dependendo da necessidade experimental. Tivemos um bom sucesso na utilização das células congeladas por expansões em um momento posterior. NOTA 5. A fim de permitir espaço para erro recomendamos a utilização de um mínimo de 7×10 5 células NK ressuspenso em 700 uls de Nkem e 5 4×10 calceína-AM células-alvo manchada ressuspenso em 4 mL de Nkem para a configuração do ensaio de citotoxicidade. Se estiver usando uma pipeta multicanal para semeadura células-alvo volumes mais altos de células (até 6×10 5 em 6 mL) pode ser necessário com base no tamanho da mídia de bacia a ser utilizado. Também o número de células NK recomendado especificamente para a E: T mostram índices no protocolo, para a utilização de maior E: relações T aumentaro número de células NK por mL em conformidade (por exemplo, para um 40:1 E: T 4×10 uso proporção 6 células / mL) NOTA 6. Recomendamos realizar uma titulação calceína-AM carregamento preliminar para a linhagem de células-alvo de escolha, utilizando os seguintes diluições de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 para alcançar diferença ideal entre a liberação máxima e espontânea. NOTA 7. Ao usar uma linha de células aderentes como alvo, primeiro preparar a suspensão única célula usando não enzimático celular buffer de dissociação. Se estiver executando ADCC, prepare um tubo duplicata de células-alvo no CAM-media. NOTA 8 Se executar ADCC, adicione mesmas células NK a 3 poços correspondentes a 10:1 E:. T para o ADCC. Repita o procedimento para doadores adicionais. Repita o procedimento para as células-alvo adicional. NOTA 9. Se realizar um experimento ADCC, após 45 minutos de carregamento calceína, adicione 10ug de anticorpos específicos para induzir o ADCC contra as células-alvo. Após mais 15 minutos, lave as células-alvo em meio completo, duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. Ressuspender as células em 1×10 5 células / mL e prossiga com a próxima etapa do protocolo. 6. RESULTADOS REPRESENTANTE Figura 2. Quando a expansão é realizada conforme o esquema descrito acima, usando 5×106 PBMCs como matéria-prima, típica das células NK rendimento varia de 1×10 outubro 09-10 células (variabilidade doador dependente). A figura mostra a expansão de células NK vezes (n = 19) em comparação com as células NK presentes no produto original (média + / – quartil). Figura 3. As células NK expandidas expressar vários receptores de células NK que são comparáveis ​​aos unexpanded principal células NK com algumas exceções (CD11b, CD160 e CD244). Figura 4. PBMCs recuperação de Buffy coat é doador dependente e pode variar de 6 a 300×10 800×10 6. Células NK pode incluir 2% – 18% das PBMCs. Para a purificação RosetteSep de células expandidas, recuperação de pura células NK no dia 14 faixas de 40-70%. Seguindo o protocolo recomendado de expansão e purificação, a pureza das células NK de 99% pode ser esperado. Figura 5. Expanded células NK demonstraram citotoxicidade contra uma série de linhagens de células tumorais, incluindo neuroblastoma, AML, osteosarcoma e melanoma (representante matando AML mostrado como lise por cento específico).

Materials

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

• 90% RPMI 1640 (Cellgro)
• 10% Fetal Bovine Serum (Gibco)
• 1x Penicillin / Streptomycin (Cellgro)
• 1x L-Glutamine (Gibco)
  • Filter Sterilize media before use.
• 50 U/ mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)
  • – Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.

PBMC and NK Cell Isolation

• Ficoll-Paque (GE Healthcare)
• Alsever’s solution (Sigma)
• RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies)

NK Cell Cytotoxicity Assay

• Calcein-AM (Invitrogen)
  • Stock solution is at 1mg/ mL, store frozen in 50 μL aliquots. Dissolve in NKEM media to achieve desired dilution for cell staining.

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below;

	Antibody	Volume per Test	Company	Catalog number
Tube 1	Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tube 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2/3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R&D Systems Miltenyi Biotec R&D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tube 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tube 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tube 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42