一个悬重系统使用隔离肾动脉闭塞

Summary

因缺血而精确的小鼠模型为急性肾损伤（AKI）是一个重要的工具，调查急性肾损伤，并有可能找到治疗肾损伤的治疗手段。悬重系统提供了一个即时和可靠的肾动脉闭塞再灌注的工具，没有引起肾充血。

Abstract

在住院的病人中，超过50％的急性肾损伤（AKI）的情况下引起的^肾缺血1-3。一个住院的病人最近的一项研究显示，只有血清肌酐水平轻度增加（0.3〜0.4毫克/升）大于70％，在没有任何^增加 1人死亡风险。沿着这些路线，手术过程中，需要交叉夹紧的主动脉和肾血管与肾功能衰竭率高达^30％，4 。同样，超过10％的患者在正常情况下，心脏手术后AKI的发生与死亡率大幅增加有关。 AKI的是肝移植术后常见的并发症。至少有8-17％的患者最终需要肾脏替代治疗^5。此外，由于肾小管细胞损伤在肾移植肾功能延迟是经常与缺血相关AKI的^6。此外，AKI的发生在约20％的患者患^败血症 6。AKI的发生是与急剧增加的发病率和^死亡率 1关联。治疗方法是非常有限的，多数在AKI的介入试验，在人类的失败。因此，迫切需要额外的治疗方式，以防止缺血肾损伤^3，7-9。

为了阐明肾损伤的机制因缺血和小鼠模型可能的治疗策略是集中需要^7-13。小鼠模型提供利用不同的遗传模型，包括基因靶向小鼠和组织特异性的基因靶向小鼠（CRE – flox系统）的可能性。然而，小鼠肾缺血是在技术上具有挑战性和实验细节显着影响的结果。我们进行了系统评价的一种新型模式，为分离出小鼠肾动脉闭塞，特别是避免使用夹紧或缝合肾^蒂 14 。这种模式需要一个肾切除右肾，因为缺血，可只有一个肾，由于实验设置执行。事实上，通过使用吊重系统，肾动脉只有仪表曾经在整个手术过程。此外，无静脉或尿道梗阻发生这种技术。通过测量血清肌酐，我们能证明与缺血时间剂量依赖性和高度重复性的肾损伤。此外，缺血预处理与传统的夹紧整个蒂，肾保护这种新的模式进行比较时，，是更深刻，更可靠。因此，他的新技术可能会在急性肾损伤领域工作的其他研究人员的有用。

Protocol

总论所有操作应执行下一个堂堂正正的解剖显微镜（Leica），并通过使用手术凝固剂。应在实验组小鼠在年龄和体重相匹配，以确保结果的可比性。在实验过程中，应该是稳定的，体温，血压，麻醉和流体管理和监测。 1。麻醉和手术肾缺血实验中，可以同时申请两个肾缺血再灌注后，或单肾切除术相结合，与其余肾缺血治疗。由于双边的两个肾脏缺血治疗是增加技术上的困难，更复杂的实验设置和较长的手术，我们将执行一个正确的悬重系统利用剩余的左肾治疗缺血性肾切除术。我们也利用这个吊重系统在心脏冠状动脉阻塞。但是，该过程是不同的，因为肾动脉，可以从周围组织中分离，而在于心脏肌肉的冠状动脉内。 小鼠（8-14周龄，雌雄不限）将被麻醉的剂量70mg/kg戊巴比妥。我们将保持约麻醉。 10毫克/公斤/小时戊巴比妥钠。过量可显着降低血压，从而可以改变的结果。在我们最初的研究中，我们也使用氯氨酮和甲苯噻嗪。然而，这些化合物诱导强大的心动过缓（150 /分）。的观察心动过缓旁边也有证据表明，这两种化合物是在缺血的情况下保护机制所涉及的。挥发性麻醉剂不能使用或是由于他们的能力，也诱发肾脏保护和低血压。因此，我们最终选择麻醉的是苯巴比妥。此外，氯胺酮和甲苯噻嗪主要由肾脏排出体外。肾切除术和缺血可能延长氯胺酮麻醉。 一旦疼痛反射缺席（镊子挤压脚趾测试）将被置于小鼠在加热温度控制表（RT，埃芬博格，德国慕尼黑，体温保持在37.0 ° C）在左边侧卧位置。 用胶带将较低和上肢表。 对于非生存的手术，如视频演示中，用矿物油覆盖切口区，以防止切割皮肤吸入鼠毛，从而防止鼠毛过敏的风险。在求生存实验的情况下，适当的无菌技术，包括裁剪的头发，皮肤消毒用碘伏（如优碘），蒸压仪器的无菌处理和使用口罩一个外科医生的无菌手套是必需的。生存手术中不使用矿物油。为了生存手术使用无菌氯化钠用剪刀和凝血电极（ERBE，ICC50，德国），以防止肌肉和皮肤血管出血，右侧切口将执行。在通过中线开腹访问肾脏，这种技术不需要进入腹腔。 使用4 / 0丝线缝合，右肾剪刀将被削减，而不会干扰与肾上腺皮质血管，包括肾动脉和肾静脉，肾蒂结扎。 手术伤口是使用肌壁和皮肤用4 / 0缝线连续缝合两针封闭。 动物，然后放置在右侧卧的位置和左翼切口将被执行。 左肾小心取出的结缔组织，避免肾上腺和船只。 接下来，打开肾脏腹侧下降到一个有机玻璃杯。有机玻璃杯应消毒的生存手术。与周围组织的一个钳，肾极小心推入有机玻璃杯。此后，极是仔细有机玻璃杯推到一个镊子。肾脏将保持潮湿和温暖，用湿棉签用清水浸泡在37.0 ° C。 肾者，暴露左肾和安置到一个有机玻璃杯克制腹侧肾血管紧张。一个足够的限制是很重要的一个肾动脉下成功就业的缝合。此后，肾脏的人是固定的，可以很容易地确定肾动脉，肾静脉上运行。 肾动脉解剖从​​邻近组织，从腹主动脉用细镊子起飞。从最高层的一个弯钳的基本静脉动脉剥离。 被放置在肾动脉，通过一个8 / 0丝线缝合（爱惜康，日本东京，德国）作为一个领先的指南钳。这种技术允许在不中断只有动脉血流肾肾静脉受压，较肾蒂夹紧。 缝合是放置在一个小杆（可事先准备好的安全别针），重量约。 1G是连接到每个（Eppendorf管）。肾脏大小或添加到Eppendorf管中的水的重量，可适应。然而，动脉应稍微拉向上，使没有血液通过动脉，但没有对动脉的主要舒展运行。主要拉伸应力对动脉可引起动脉壁的增厚和减少再灌注血管壁损伤。 虽然重量是不受支持的，立即肾动脉闭塞。相反，当的权重支持，立即恢复血流的器官。成功闭塞证实的颜色从红色变为白色。 不同缺血时间可以进行实验的要求。一个完整的再灌注缺血时间的长短取决于将发生。缺血时间长达45分钟让可收回肾损伤。在我们的实验设置中，我们用20高达30分钟，缺血与一个中等的肾损伤，这让我们看到了改善，以及根据小鼠品系和治疗的肾脏损害减值。 完成再灌注后肾脏可以更换的有机玻璃杯。因此肾脏的持有人是不固定的，对肾脏的紧张被释放。颅极轻轻的杯子中剔除出去，不愠不火的镊子和尾杆紧随。 可以释放鼠标的固定（磁带）和鼠标就可以放置在仰卧姿势如FITC -菊粉标记间隙。 在实验的子集，血压和心率，可以记录整个手术过程。血压测量得到不断通过颈内动脉导管。总之，颈内动脉通过钝性分离气管肌肉暴露。经过进一步的接触和小心避免组织创伤（尤其是迷走神经），导管插入使用两个缝线和一个小钳的船只。测量血压是一个statham元素（280 WK，王氏港建，Kaltbrunn，瑞士）。 对于FITC标记的菊粉间隙导管将放在左侧颈内静脉滴注氯化钠和FITC标记的菊粉。此外，膀胱导管插入尿液收集在一个随时间变化的的方式将在下面详细解释。 2。肾损伤的测量一般建议：下面的结果参数，以确定肾损伤，肾缺血： 执行FITC标记的菊粉的间隙，以评估肾小球滤过率（GFR）。作为替代方案确定通过代谢笼调查24小时，肾功能损伤后的肌酐清除率和血清肌酐。执行肾H＆E染色和一个过氧化物酶（MPO）ELISA法，以确定肾功能损害和炎症24小时，肾缺血。 代谢笼调查： 左肾缺血转身进入腹膜后的位置，如上所述，伤口闭合。 小鼠在手术结束时，收到0.3毫升生理盐水IP和下加热灯2小时的恢复。 此后，老鼠将被放入代谢笼（Tecniplast德国，Hohenpeissenberg，德国），肾功能参数测定24小时的2倍。 每只小鼠的取水口已确定称重水空和填充瓶供应前鼠标比24小时后再次称重满瓶。鼠标的重量以及待定。 24小时后约75μl血从眼睛后方的静脉丛通过短isoflorane麻醉下的毛细管。 通过测量肾使用市售的colorimtric方法，根据制造商的协议（LT – SYS的，劳动+技术公司，德国柏林）缺血后血浆和尿肌酐24小时的肾功能评估。血浆和尿钠 ，钾浓度+决心与火焰发射光度计（6361 ELEX的Eppendorf公司，汉堡，德国）。肾脏的排泄和血液动力学的价值观是使用 15-17标准的公式计算。 菊粉间隙：FITC -菊粉清除实验将执行以下肾缺血。 左侧颈内静脉插管连续的Infusion。解剖后从邻近组织的静脉用一备剪刀（杜蒙，WPI），放置两个缝线周围静脉（4 / 0）。放置之前，阻止血液流向proximale缝合静脉钳。此后，关闭远端结和重量放在远端缝合结束应变静脉紧张。静脉导管，这是非常重要的。使用微型剪刀切一个小口进入静脉。保持开放与罚款钳（杜蒙，WPI），并放入静脉导管。为了推进导管钳断。确保没有导管的张力，让你可以无需拿着它下来。随后关闭近端缝合静脉导管在第二。 导管放置在定时收集尿液的膀胱。因此，你切一个小切口，在皮肤，膀胱。通过皮肤孔，小心地取出膀胱。用湿纸巾修复膀胱。放置在膀胱（4 / 0）准备缝合。 剪下一小段导管（1.5厘米）结束的热量，这使得它更容易在膀胱修复导管周围的一环。 削减其极顶一个孔进入膀胱。请削减之间的船只，以防止出血。插入导管进入膀胱的大底和关闭通过导管和膀胱的缝合。 所有的老鼠收到0.85％氯化钠溶液中静脉推注，金额相等于体重的20％。连续输液维持在800ul/h/25g体重和FITC标记的菊粉是评价整个肾脏肾小球滤过率（GFR）的输液率。 20分钟的动物稳定后，20分钟定时尿液集合进行测定尿流率和FITC -菊粉（四次）。血液是在每测量FITC -菊粉期间中获得。 当开始20分钟收集期间使用一个计时器。收集尿液，由一个小的Eppendorf管放入膀胱导管结束。测量前后收集尿液，使你能确定尿量管重量。 retroorbital血液收集的形式，通过在每个收集期中的毛细管静脉丛通过采取血液样本。 后进一步分析，如MPO ELISA法，细胞因子的EISA，组织学的每个程序，可采集血液和肾脏。 3。代表性的成果： 图1吊重系统为肾缺血模型：一个悬重系统已经建立，导致左肾肾缺血。因此8.0尼龙缝线划归肾动脉和一个小，重量轻（1G）附加在每个缝合结束。这个实验设计允许申请和释放的重量负荷可逆的肾动脉闭塞。

Discussion

综上所述，本研究介绍了一种在小鼠模型使用一个吊重系统为肾动脉闭塞的肾缺血的新技术。事实上，这项研究表明高度重复性的伤害，从而最大限度地减少钳夹肾蒂的变异。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Sodium Pentobarbital	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL in saline
Suture, silk 4.0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolene 8.0	Ethicon, USA	M8739	reusable
dissecting microscope	Leica	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Surgical instruments	WPI, Dumont		a fine microvessel scissor