隔離された腎動脈閉塞のためのハンギングウェイトシステムの利用

Summary

虚血による急性腎障害のための正確なモデルマウス（AKI）は、急性腎障害を調査し、場合によっては腎障害を治療するための治療手段を見つけるために重要なツールです。吊り下げ重量システムは、腎渋滞を引き起こすことなく、迅速かつ信頼性の腎動脈の閉塞および再灌流のためのツールを提供しています。

Abstract

入院患者で、急性腎障害（AKI）の症例の50％以上は^1-3腎虚血によって引き起こされます。入院患者の最近の研究では、血清クレアチニン値の軽度の増加が（0.3から0.4 mg / dL）のいずれかの増加^{1を適用して}いない人に比べて死亡の70％より大きなリスクに関連付けられていることを明らかにした。これらの線に沿って、大動脈と腎血管のクロスクランプを必要とする外科手術は^、30％4までの腎不全率に関連付けられています。同様に、心臓手術後のAKIは、通常の状況下で患者の10％以上で発生し、死亡率の劇的な増加に関連付けられています。 AKIは、肝移植後にも一般的な合併症である。患者の少なくとも8から17パーセントは腎代替療法^5を必要とすることになる。また、腎移植時の尿細管細胞の傷害に起因する遅延グラフト関数は、頻繁に虚血に関連するAKI ⁶に関連しています。また、AKIは敗血症⁶から患っている患者の約20％で発生します。AKIの発生は、罹患率と死亡率¹の劇的な増加に関連付けられている。治療アプローチは非常に限られているとAKIの介入試験の大半は、人間に失敗している。したがって、虚血から腎障害を防ぐために追加の治療法が緊急に^7-9、3を必要としている。

虚血による腎障害のメカニズムと可能な治療戦略のマウスモデルを明らかにするためには、集中的に^7-13を必要としている。マウスモデルは遺伝子標的マウスと組織特異的遺伝子標的マウス（CRE – FLOXシステム）を含むさまざまな遺伝的モデルを活用する可能性を提供しています。しかし、マウス腎虚血は技術的に困難であり、実験の詳細は、大幅に結果に影響を与える。我々は、特に腎茎^14をクランプや縫合の使用を避けるマウスでの孤立性腎動脈閉塞のための新しいモデル、の体系的評価を行った。虚血が唯一の実験設定によって1腎臓で行うことができるので、このモデルでは右腎の腎摘除術を必要とします。実際には、ハンギングウェイトシステムを使用することにより、腎動脈の外科的処置を通じて一度だけ計測されています。さらに、どの静脈や尿道閉塞は、この手法では発生しません。我々は、血清クレアチニンを測定することにより、虚血時間用量依存性および再現性の高い腎障害を示すことができる。また、全体の茎のクランプ、従来でこの新しいモデルを比較する際に、虚血プレコンディショニングによる腎保護は、より深い、より信頼性の高いです。したがって、彼の新しい技術は、急性腎障害の分野で作業している他の研究者にとって便利かもしれません。

Protocol

一般的な挨拶 ​​。すべての操作は、直立解剖顕微鏡（ライカ）の下と外科的凝固を使用して実行する必要があります。実験群のマウスには、結果の比較可能性を確保するために年齢と体重に一致する必要があります。温度、血圧、麻酔と輸液は、実験中に安定して監視する必要があります。 1。麻酔と手術腎虚血の実験は、どちらかを同時に両方の腎臓に血と再灌流を適用する、または残りの腎臓の虚血の治療と組み合わせて単一の腎摘出後に行うことができます。両方の腎臓の二国間の虚血の治療が増加技術的な問題が、より複雑な実験設定と長い手術に関連付けられているように、我々は掛かる重量のシステムを利用して、残りの左側の腎臓の虚血の治療に続いて、右腎摘出を実行します。我々は、心臓の冠状動脈の閉塞のためにも、このハング重量のシステムを利用。冠状動脈は心臓の筋肉内にあるのに対し、腎動脈が周囲の組織から単離することができるしかし、手順は異なります。 マウス（8-14週齢、雌雄は）70mg/kgの用量でペントバルビタールで麻酔になります。我々は、約で麻酔を維持します。ペントバルビタール10 mg / kgの/ hのナトリウム。過剰投与は有意に血圧を下げることができますので、結果を変更することができます。私たちの初期の研究で我々はまた、ケタミンとキシラジンを使用していました。しかし、これらの化合物は強い徐脈（150 /分）を誘導した。観測された徐脈の横にある両方の化合物は、虚血の状態の間に防御機構に関与しているという証拠もある。揮発性麻酔薬はまた、腎保護と低血圧を誘発するか、その能力のために使用することができます。したがって、麻酔のための私たちの最終的な選択は、ペントバルビタールだった。さらに、ケタミンとキシラジンは、主として腎臓から排泄される。腎摘出術と虚血は、ケタミン麻酔を延長することがあります。 一度痛みの反射がないです（ピンセットで足の指を絞ってテストした）マウスは左側臥位に（RT、Effenberg、ミュンヘン、ドイツ37.0℃で体温を維持するために）温度制御加熱のテーブルの上に配置されます。 テープを使用してテーブルに下限と上肢を取り付けます。 ビデオのデモに示すような非生存手術、の場合は、皮膚をカットすることで、マウスの毛の吸入を防止するため、マウスの毛のアレルギーのリスクを防ぐためにミネラルオイルを切開面積をカバー。生存実験の場合には毛のクリッピング、ヨードフォア（例えばBetadine）、オートクレーブ器具の滅菌処理し、外科医のためのマスクを使用すると、滅菌手袋と皮膚の消毒を含む適切な無菌テクニックが必要です。ミネラルオイルは、生存の手術では使用されません。生存の手術のために無菌NaClを使用されています右側腹部の切開は、筋肉と皮膚血管の出血を防ぐために、はさみや凝固電極（エルベ、ICC50、ドイツ）で実行されます。正中開腹術を経由して腎臓へのアクセスとは対照的に、この手法は、腹腔へのアクセスを必要としません。 腎動脈および腎静脈を含めた腎茎は4 / 0絹縫合糸を使用して連結すると右の腎臓は副腎血管に干渉することなく、はさみで切り出しされます。 手術創は4 / 0縫合糸で筋肉の壁と皮膚の連続縫合（二ステッチ）を使用してクローズされます。 動物は、右側臥位に置かれ、左脇腹の切開が行われます。 左腎は慎重に副腎や血管を避けて、結合組織から削除されます。 次に、腎臓は、ルーサイトカップにその腹側に下がっている。ルーサイトカップは、生存の手術のために滅菌されるべきである。腎臓のポールは、ピンセットで慎重に周囲の組織を保持することによってルーサイトカップにプッシュされます。その後ポールは、ピンセットで慎重にルーサイトカップにプッシュされます。腎臓は37.0で、水に浸したウェット綿棒℃でウェットと保温されるルーサイトカップに左腎および配置の曝露後の腎臓のホルダーは、腎血管の緊張を持つように腹側に拘束される。十分な差し止めは腎動脈下の縫合糸の成功を配置するために重要です。その後腎臓ホルダーが固定されており、それが腎静脈の上で動作するように腎動脈を簡単に識別できます。 腎動脈が隣接する組織から解剖され、その微細な鉗子による腹部大動脈から離陸に近い。動脈は非常に上部に湾曲したピンセットを用い、基盤となる静脈から解剖される。 8 / 0絹縫合糸（エチコン、ノルダーシュテット、ドイツ）を用いて腎動脈の下に置かれている主要なガイドとして1つの鉗子。この手法は、腎茎のクランプに比べて、腎静脈の圧縮せずに腎臓への唯一の動脈の血流の中断することができます。 縫合糸は、小さな極（準備安全ピンすることができます）と約の重みの上に配置されています。 1グラムは、各エンド（エッペンドルフチュー​​ブ）に接続されています。重量は、取り出したり、エッペンドルフチュー​​ブに水を添加することによって腎臓の大きさに適合させることができます。しかし、動脈が少しは血液が動脈を介してですが動脈に大きなストレッチなしで実行されていないように、上向きにプルアップしてください。動脈に大きなストレッチストレスは、動脈壁と低灌流の肥厚を伴う血管壁の損傷を引き起こす可能性があります。 重みがサポートされていない一方で、腎動脈はすぐに吸蔵される。これとは対照的に、重みがサポートされている場合、血流はすぐに臓器に復元されます。成功した閉塞は、赤から白への色の変化によって確認される。 実験で必要に応じて異なる虚血時間を行うことができます。完全な再灌流は、虚血時間の長さに応じて行われます。 45分の虚血時間までには回復可能な腎臓の損傷を許可する。我々の実験設定では、私たちが改善だけでなく、マウスの系統や治療に応じて、腎臓の損傷の障害を確認することができる培地腎障害と虚血の30分に20までを使用。 完全な再灌流後に腎臓は、ルーサイトカップの外に置き換えることができます。したがって、腎臓ホルダーは未定であり、腎臓の緊張が解除されます。頭蓋ポールは、優しく穏やかな鉗子でカップから削除され、尾側のポールは、すぐに次のようになる。 マウスの固定（テープ）がリリースすることができ、マウスは、例えば、FITC標識したイヌリンクリアランスのため仰臥位に配置することができます。 実験のサブセットでは、血圧と心拍数は、手術全体に記録することができます。血圧の測定は、頸動脈カテーテルを介して連続的に取得されます。簡単に言えば、頚動脈を気管筋の鈍的切開を介して公開されます。さらなる暴露と組織の外傷（迷走神経の特定）を慎重に回避に続いて、カテーテルは、2つの縫合糸と小さなクランプを使用して血管に挿入されます。血圧は、ステイサムの要素（WK 280、WKK、カルトブルン、スイス）で測定されます。 FITC標識イヌリンクリアランスのためにカテーテルは、塩化ナトリウムとFITC標識イヌリンの注入のために左頸静脈内に配置する必要があります。さらに膀胱のカテーテルは、以下に詳細に説明するように時間依存的に尿を採取するために挿入する必要があります。 2。腎損傷の測定一般的には：以下のアウトカムパラメーターには、腎臓の虚血後の腎臓の損傷を判断するために推奨されています： 糸球体濾過率（GFR）を評価するためにFITC標識イヌリンクリアランスを実行します。代替として、24時間腎損傷後の代謝ケージの調査を経由してクレアチニンクリアランス、血清クレアチニンを決定する。腎H＆E染色および腎虚血、以下の腎損傷や炎症、24時間を決定するためにミエロペルオキシダーゼ（MPO）ELISAを実行します。 代謝ケージの調査： 虚血後の左の腎臓は、後腹膜の位置に戻して電源が入っていて、上記のような傷が閉じている。 手術の終了時にマウスは、0.3ミリリットルの生理食塩水のIPを受信し、加熱ランプの下で2時間回復する。 その後、マウスは24時間の2倍のための腎機能パラメータの測定のための代謝ケージ（Tecniplastドイツ、Hohenpeissenberg、ドイツ）に配置されます。 各マウスの取水は、再び完全なボトルを秤量することにより、マウスに供給する前に水と空と満たされたボトルを秤量することにより、24時間後より決定する必要がある。マウスの重量は、同様に決定する必要がある。 24時間後、約75μlの血液が短いisoflorane麻酔下でキャピラリーチューブを介して目の奥に静脈叢から取得されます。 腎機能は24時間製造業者の`sのプロトコル（LT – SYS、労働+ Technik社、ベルリン、ドイツ）によると、市販のcolorimtric方法を使用して腎虚血後の血漿および尿中のクレアチニンを測定することによって評価される。のNa +、K +の血漿および尿中濃度は、火炎放射光度計（エレックス6361、エッペンドルフAG、ハンブルク、ドイツ）で決定される。腎排泄と血行動態値は、標準の数式15から17を使って計算されます。 イヌリンクリアランス：FITC -イヌリンクリアランスの実験は、腎虚血、次が実行されます。 左頸静脈は、連続的な私のためにカニューレnfusion。準備のはさみ（デュモン、WPI）場所静脈約2縫合糸（4 / 0）で、隣接する組織から静脈を切開した後。血流を停止するproximale縫合する前に静脈にクランプを置きます。その後、遠位結び目を閉じて、遠位縫合糸は、静脈の緊張を引っ張らないように終わるのいずれかに重みを置く。これは、静脈にカテーテルを得るために非常に重要です。静脈に小さな開口部をカットするマイクロはさみを使用してください。微細な鉗子（デュモン、WPI）と開口部を保持し、静脈にカテーテルを配置。カテーテルのクランプを脱いで進みます。あなたがそれを保持することなく、それを下に置くことができるようにカテーテルには緊張感がないことを確認してください。その後、静脈とカテーテルでの秒の近位縫合を閉じてください。 カテーテルは、計時尿のコレクションのための膀胱に配置されます。したがって、膀胱の皮膚の短い切開をカット。慎重に皮膚の穴から膀胱を削除します。ウェットティッシュで膀胱を修正。膀胱（4 / 0）上の準備縫合糸を置きます。 それは容易に膀胱内にそれを修正するために行うカテーテルの周囲にリングを得るために最後の短いカテーテルの一部（1.5センチメートル）と熱をカット。 その一番上に膀胱に穴を開けます。出血を防ぐために血管の間のカットを行います。膀胱内にカテーテルの大端部を挿入し、カテーテルや膀胱を介して縫合糸を閉じます。 すべてのマウスは体重の20％に相当する金額の0.85％塩化ナトリウム溶液のボーラスを受け取ります。持続注入は、体重とFITC -イヌリンを800ul/h/25gの割合で維持されている全体の腎臓の糸球体濾過率（GFR）の評価のために注入するために追加されます。 20分間の動物の安定化した後、20分計時尿のコレクションは、尿流率およびFITC -イヌリンの測定のために（4回）実行されます。血液は、FITC -イヌリンの測定のためのすべての期間の途中で得られる。 20分の収集期間を開始するときは、タイマーを使用してください。小さいエッペンドルフチュー​​ブに膀胱カテーテルの端を置くことによって、尿を収集する。もし尿の量を決定できるように、尿を採取する前と後のチューブの重量を測定する。血液サンプルは、各収集期間の途中でキャピラリーチューブを経由して眼窩採血フォーム静脈叢を介して行われます。 血液および腎臓は、さらに分析などMPO ELISA、サイトカインEISA、組織学のための各手順の後に収集することができます。 3。代表的な結果： 図1腎虚血用ハンギングウエイトシステムのモデル：。ハング重量システムは左腎の腎血を誘発するために確立されている。したがって、8.0ナイロン縫合糸は、腎動脈下に置かれ、それぞれの縫合糸の端にある小さな重量（1G）が装着された。この実験的な設計は、重量負荷を適用し、解放することによって腎動脈の可逆的閉塞することができます。

Discussion

要約すると、本研究は、腎動脈の閉塞のためにぶら下げウェイトシステムを使用して、マウスモデルで腎虚血を実行するための斬新な手法を説明します。実際には、本研究はこのように腎茎のクランピングに関連した変動を最小限に抑え、高い再現性傷害を示しています。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Sodium Pentobarbital	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL in saline
Suture, silk 4.0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolene 8.0	Ethicon, USA	M8739	reusable
dissecting microscope	Leica	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Surgical instruments	WPI, Dumont		a fine microvessel scissor