Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine
Summary
Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.
Abstract
L'homéostasie de tous les tissus d'auto-renouvellement est dépendant sur les cellules souches adultes. Comme les cellules souches indifférenciées subissent des divisions asymétriques, elles génèrent des cellules filles qui gardent le phénotype de cellules souches et de transit d'amplification des cellules (cellules TA) qui migrent de la niche de cellules souches, subissent la prolifération rapide et en phase terminale se différencier pour repeupler le tissu.
Les cellules souches épithéliales ont été identifiés dans l'épiderme, du follicule pileux, et de l'intestin que les cellules avec un haut potentiel prolifératif in vitro et en tant que lente vélo étiquette de rétention des cellules in vivo 1-3. Adulte, tissu-spécifique des cellules souches sont responsables de la régénération des tissus dans lesquels ils résident pendant le changement physiologique normale, ainsi que pendant les périodes de stress 4-5. Par ailleurs, les cellules souches sont généralement considérés comme étant multi-puissant, possédant la capacité de donner naissance à plusieurs types de cellules dans le tissu 6. Par exemple, les cellules de rongeurs souches du follicule pileux peut générer l'épiderme, les glandes sébacées et les follicules pileux 7-9. Nous avons montré que les cellules souches provenant de la région bulbe du follicule pileux humain présentent multi-potentialité 10.
Les cellules souches sont devenues un outil précieux dans la recherche biomédicale, en raison de leur utilité comme un système in vitro pour étudier la biologie du développement, la différenciation, la tumorigenèse et de leur utilité thérapeutique possible. Il est probable que les cellules souches adultes épithéliales sera utile dans le traitement de maladies telles que dysplasies ectodermiques, monilethrix, Netherton syndrome, la maladie de Menkes, l'épidermolyse bulleuse héréditaire et alopécies 11-13. En outre, les autres problèmes de peau tels que des brûlures, des plaies chroniques et des ulcères bénéficieront de thérapies aux cellules souches 14,15. Etant donné le potentiel de reprogrammation de cellules adultes dans un état pluripotentes (cellules iPS) 16,17, les cellules facilement accessibles et extensible souches adultes dans la peau humaine peut fournir une source précieuse de cellules pour l'induction et le traitement en aval pour un large éventail de maladies, y compris le diabète et la maladie de Parkinson.
Protocol
Discussion
Les méthodes d'extraction de cellule et la culture sont étonnamment faciles décrit et reproductible. Nous avons généré cultures de cellules souches épithéliales de plusieurs dizaines de personnes à travers une large tranche d'âge, y compris les patients avec des défauts de la peau a hérité de 18 ans. Il est préférable de commencer le processus le jour de la récolte des tissus, mais les cellules restent viables dans les médias sur la glace pendant plusieurs jours, ce qui facilite expé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est financé par le NIH / NCI octroi R01CA-118916
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | GIBCO | 11995 | ||
| Hams F12 | GIBCO | 11765 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | 16000 | ||
| Insulin | GIBCO | 12585 | ||
| T3 | Sigma | T-2752 | ||
| Transferrin | Roche | 10652202001 | ||
| Hydrocortisone | Sigma | H-4001 | ||
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | ||
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E-9644 | ||
| Adenine | Sigma | A9795 | ||
| Trypsin(10X) | GIBCO | 15090 | ||
| VERSENE | GIBCO | 15040 | ||
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | ||
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma | H6648 | ||
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | ||
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | ||
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
| Dispase | Invitrogen | 17105 | ||
| Crystal Violet | Fisher | C581-25 |
Keratinocyte media (KCM)
[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2]
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