Fisk för preimplantatorisk genetisk diagnos

Summary

Denna artikel beskriver valet av lämpliga givare för encelliga FISK, sprida tekniker för blastomere kärnor, och in situ hybridisering och signal poäng, gäller för preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) i en klinisk miljö.

Abstract

Preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) är ett etablerat alternativ till fosterdiagnostik, och innebär att välja pre-implantation embryon från en kohort som genereras av assisterad befruktning teknik (ART). Detta urval kan krävas på grund av familjär monogena sjukdomar (t.ex. cystisk fibros), eller för att en partner bär på en kromosom ombildning (t ex en två-vägs ömsesidiga translokation). PGD ​​är tillgänglig för par som tidigare har påverkat barnen, och / eller i händelse av kromosom omdisponeringar, upprepade missfall eller infertilitet. Oocyter aspirerat efter ovulationsstimulering befruktas av in vitro-nedsänkning i sperma (IVF) eller intracytoplasmatisk injektion av en enskild spermie (ICSI). Preimplantatorisk klyvning steg embryon biopsier, vanligen genom att ta bort en enda cell på dag 3 efter befruktning, och biopsier cellen testas för att fastställa den genetiska statusen av embryot. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) på den fasta kärnan av biopsier celler med mål-specifika DNA-prober är den teknik val för att upptäcka kromosom obalans i samband med kromosom omorganiseringar, och att välja kvinnliga embryon i familjer med X-bunden sjukdom som det inte finns ingen mutation-specifika test. FISK har också använts för att screena embryon för spontana kromosom aneuploidi (även känd som PGS och PGD-AS) i syfte att försöka förbättra effektiviteten i assisterad befruktning, men beskrev det prediktiva värdet för denna test med att sprida och FISH tekniken här sannolikt är oacceptabelt låg i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning. Vi beskriver valet av lämpliga givare för encelliga FISK, sprida tekniker för blastomere kärnor, och in situ hybridisering och signal poäng, gäller för PGD i en klinisk miljö.

Protocol

1. Lysing och sprider en kärna från en biopsier Blastomere Cell lyseringsbuffert för spridning av celler (0,2% Tween20 i 0,01 M HCl, pH 2,0) bör utarbetas 24 timmar i förväg och förvaras vid -20 ° C. Bereda 100 ml och filtrera 20 ml i en 30 ml steril universella behållare med en steril 20 ml spruta och filtrera spruta. Tillsätt 1 ml-portioner i 10-15 1,7 ml sterila mikrocentrifugrör, nära och etikett rören före frysning. Det rekommenderas att ha två olika partier är att använda den nya parti och det tidigare partiet, som har testats och kan användas om det nya partiet är otillfredsställande. Frosta av lyseringsbuffert i rumstemperatur 30 minuter före biopsi förfarande. Av praktiska skäl arbetstemperaturen kommer att vara mellan rumstemperatur och hand temperatur. Betyg en liten cirkel (ca 5 mm diameter) på undersidan av en amin-belagd slide (t.ex. Genetix) med en diamant penna och pre-märka bilden med ärendenummer, unika bildnummer, och biopsi datum. Använd en separat bild för varje blastomere i nummerordning och etikett med embryot nummer. Diabilder bör märkas med en hård penna som 4H, och "utplånas" med en latex handske för att ta bort grafit damm. Placera en liten mängd lyseringsbuffert inom cirkeln. Överför biopsier blastomere i lyseringsbuffert. Om det behövs lägger lyseringsbuffert inom cirkeln tills cellen börjar lysera, cellen ska Lyse helt och cytoplasman skingra innan bufferten torkar. Observera kärnan för att säkerställa att det förblir inom cirkeln och är inte förlorad, om cellen inte har någon kärna eller har flera kärnor, biopsi annan cell. Lämna bilden för att lufttorka i rumstemperatur. 2. In Situ Hybridisering av ett gemensamt Blastomere Nucleus Förbered en etanol-serien (70, 90 och 100%) består i sterilt destillerat vatten. Slå på och ställ in den heta blocket (t.ex. Hybaid Omnislide eller Vysis Hybrite) till 75 ° C. Defrost sonder, virvel, och centrifugera. Reagensen ska bevittnas och verifieras vara korrekt innan upp sonden blandningen. Pipettera volymer som anges av tillverkaren för att ge sonden blandningen i en 0,65 ml sterilt mikrocentrifugrör och vortexa och centrifugera före användning. Den totala volymen av probe Blandningen ska vara tillräcklig för att tillåta 2 mikroliter per kärna som ska testas och avrundas uppåt till närmaste 10 mikroliter för att möjliggöra en säkerhetsmarginal. Förtvätt bilderna i Coplin burkar med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (pH 7,0: 0,14 M NaCl, 3 mm KCl, 10 mm Na 2 4 HPO, 2 mm KH 2 PO 4) under 5 minuter vid rumstemperatur. Skölj objektglasen två gånger i sterilt destillerat vatten. Torka objektglasen med etanol-serien (70, 90 och 100%) i 2 min vardera vid rumstemperatur och lufttorka. Se till att bilderna är helt nedsänkt och om någon grafit damm flyter upp till ytan, sug upp med en ren vävnad. Rekord ställning kärnan inom cirkeln genom att visualisera med ett faskontrastmikroskop. Torka med 100% etanol i 2 minuter i rumstemperatur och lufttorka. Applicera 2 mikroliter av sond blandningen och täck med en 9 x 9 mm täckglas (en fjärdedel av en 18 x 18 mm no.1 täckglas). Täta kanterna på täckglas med gummi cement (t.ex. Cow tandköttet, Cow Proofing). Codenature glasen på en varm kvarter vid 75 ° C i 5 min, och sedan hybridisera bilderna över natten (16-20 h) i en fuktig kammare vid 37 ° C. Probe mixar som uteslutande består av centromer sonder (dvs för könsbunden fall) kommer att ge ett tillfredsställande resultat efter 60 minuter av hybridisering. Förbered ett vattenbad med tillräcklig Coplin burkar och värm till 71 ° C. Förbered en 0.4x standard saltlösning citrat (SSC) stränga tvättlösning (pH 7,0 vid 71 ° C, 0,06 M NaCl, 6 mm C 6 H 5 Na 3 O 7 .2 H 2 O) och värme i vattenbad. Tillsätt 50 ml av stränga tvätta krävs per Coplin burken och kontrollera att temperaturen är 71 ° C omedelbart före användning med en ren termometer. Ta försiktigt bort klister från varje bild och skölj bort täckglas med 4x SSC/0.05% Tween20 (pH 7,0) vid rumstemperatur. Tvätta bilderna i 0.4x SSC stränga tvätt vid 71 ° C i 5 min. Tvätta inte mer än sex bilder per Coplin burk. Tvätta bilderna i 4x SSC/0.05% Tween20 i rumstemperatur i 2 min. Om sonden blandningen innehåller indirekt märkt sond (s), dränera diabilder av överflödig vätska och tillämpa 20 mikroliter av fluorescerande antikropp i en 20 x 20 mm torget i Parafilm. Inkubera i en fuktig kammare vid 37 ° C i 15 min. Ta bort Parafilm och tvätta en gång i 4x SSC/0.05% Tween20 i rumstemperatur i 2 min. Tvätta två gånger i 2 minuter i PBS ent rumstemperatur och dränera bilder. Applicera 6 ìl DAPI / Vectashield (160 ng 4 ',6-diamidino-2-phenylindole dihydroklorid i 1 ml Vectashield monteringsmedium, Vector Laboratories) till en 22 x 22 mm nr. 0 täckglas och invertera glida över täckglas. Blot och försegla kanterna på täckglas med tydliga nagellack. 3. Analys med en fluorescensmikroskop Utrustad Lämpligt med lämpliga filter för den använda prober. Betyg signaler genom direkt visualisering med hjälp av en fluorescensmikroskop och ensamstående bandpassfilter för varje fluorokrom i analysen. Varje kärna ska bedömas av två analytiker. En allmän riktlinje bör leda till poängsättning av en enda signal där två tätt placerade signaler är mindre än en domän (signal-bredd) isär, men behöver dom baserade på erfarenhet skall utnyttjas för att tolka signaler av varierande storlek, intensitet och separation. Använd mjukvara för bildhantering (t.ex. Isis, MetaSystems, Altlussheim, Tyskland, CytoVision, Genetix) för att fånga en bild av en grundplåt för bekräftelse av den visuella diagnos, och för bildarkivering som en del av ett laboratorium för kvalitetssäkring plan. 4. Representativa resultat: Metafas och interfasen kärnor från odlade perifera lymfocyter i blod bör undersökas för att bekräfta att de valda sonder är specifika för translokation kromosomerna, informativ för brytpunkter (den subtelomere sonder ska hybridisera endast flyttad segment och centromer sond (s) till centrerad segment (s)) och de signaler i interfas kärnor ska vara ljusa och diskreta. Poängsättning antalet signaler för varje givare i 100 interfas kärnor från varje deltagande rekommenderas att bedöma effektiviteten i analysen. I det här fallet 2 signaler har gjort mål i 95% -99% av kärnorna för varje givare. Figur 1 visar en metafas och interfasen kärnan från en förberedelse för en ömsesidig translokation mellan korta armar av kromosomer 5 och 9. Signaler i interfas kärnor från embryo blastomerer bör vara ljusa och diskreta och värderade med hjälp av olika filter bandpass för de färger som används. Figur 2 visar en blastomere kärna med en normal signalmönster (2 exemplar för alla testade loci) förenlig med en normal eller balanserad kromosom komplement till kromosom 5 och 9, och en kärna med en avvikande signal mönster som överensstämmer med en obalanserad produkt av translokation som har monosomi (en kopia) för flyttad segment av kromosom 5 och trisomi (3 kopior) för flyttad segment av kromosom 9. Figur 1 En metafas spridning och en interfasen kärna som framställts av odlade perifera lymfocyter i blod från en bärare av en ömsesidig translokation mellan korta armar av kromosomer 5 och 9 med brytpunkter vid 5p14.3 och 9p24.1:. 46, XY, t (5 , 9) (p14.3;. p24.1) ish t (5; 9) (5ptel48-, 9ptel30 +; 9ptel30-, 5ptel48 +, 9cen +). FISK sonder valdes ut för både flyttad segmenten (5p14.3 → 5pter, röd Cytocell subtelomere5ptel48 TexasRed; 9p24.1 → 9pter, grön Cytocell subtelomere 9ptel30 FITC) och centrerad segment av kromosom 9 (9p24.1 → 9qter, blå Abbott CEP 9 alfa satellit SpectrumAqua). Figur 2. Signaler i interfas blastomere kärnor från dag-3 embryon som tagits med en annan filter för varje fluorokrom och slås samman till en sammansatt bild. (A) Två signaler för varje givare visar två kopior av varje locus, vilket är förenligt med en normal eller balanserat komplement för translokation kromosomerna. (B) En röd signal, tre gröna signaler och två blå signaler om ett exemplar av flyttad segment av kromosom 5, tre kopior av flyttad segment av kromosom 9 och två kopior av centrerad segment av kromosom 9, vilket stämmer överens med angränsande -1 segregation av translokationen resulterar i en obalanserad med monosomi för 5p14.3 → 5pter och trisomi för 9p24.1 → 9pter.

Discussion

Tillämpningen av fluorescens in situ hybridisering (FISH) till en enda embryo cell (blastomere) presenterar speciella utmaningar både i praktiska och i tolkningen av signalen mönster. Den biopsier cellen måste spridas inom en på förhand definierat område i bilden, för att underlätta dess lokalisering följande fiskarter; extrem försiktighet måste vidtas för att säkerställa att cellen är lyserade, att cytoplasman har skingrats, och att kärnan är synlig och intakt, och som diagnosen beror på resultaten från denna enda cell, stränga poängsättning och tolkning riktlinjer bör tillämpas. Men i erfarna händer, är FISH en robust teknik för preimplantatorisk genetisk diagnostik (PGD) i klinisk praxis. Principen om PGD av fisk är att mål-specifika DNA-prober märkta med olika fluorokromer eller haptener kan användas för att detektera kopian antal specifika loci, och på så sätt att upptäcka kromosom obalans i samband med meiotiska segregering av kromosom omdisponeringar (1), inklusive Robertsonian translokationer, ömsesidiga translokationer, inversioner och komplexa omflyttningar (2). Fisk kan också användas för att välja kvinnliga embryon i familjer med X-bunden sjukdom för vilken det inte finns någon mutation-specifika tester (3, 4). Mer kontroversiellt är FISH också använts för att screena för sporadiska kromosom aneuploidi för att försöka förbättra effektiviteten i assisterad befruktning (5, 6), men det är det prediktiva värdet av detta test med hjälp av FSIH sannolikt oacceptabelt låg i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning (7). Denna artikel koncentrerar sig på tekniska aspekter och de begränsningar som FISH tillämpas på klinisk encelliga diagnos.

Metoder för spridning och fastställande enda blastomerer innehålla metanol / ättiksyra (5, 8), Tween / HCl (9), och en kombination av Tween / HCl och metanol / ättiksyra (10). Variationer inkluderar hypoton behandling av cellerna innan de sprider sig och / eller pepsin och paraformaldehyd behandling efter fixering. Metoden bör vara lämpligt valideras för laboratoriet (14). Interpoleringen / HCl-metoden beskrivs i detalj i denna artikel. Interpoleringen / HCl-metoden är tekniskt enkel och mycket reproducerbar i olika laboratorier. Denna metod kan användas för att förbereda enstaka kärnor för FISH diagnostik av könsbestämning och omorganiseringar kromosom med acceptabla diagnostiska noggrannheten (7).

Probe mixar kan kombinera direkt märkta och indirekt märkta prober, och sonder från olika tillverkare. Sonder för kända polymorfa kromosomområden (11, 12), eller de kända för att över hybridisera signifikant med andra kromosomer (13) bör undvikas, men kan användas om visat sig vara specifik och lämplig för PGD av tidigare tester på både reproduktiv partner . Finns fluorokromer / haptener och strategier för att diskriminera sonder innehålla följande: Texas Red (TR), fluorescein (FITC), SpectrumGreen (Vysis), SpectrumOrange (Vysis), SpectrumAqua, biotinylerad sonder upptäckas med TR-avidin, FITC-avidin, eller Cy-5 streptavidin (visualiseras med en FarRed filter), en blandning av rött och grönt sonder för att producera en gul signal, en andra omgång av hybridisering och en tredje färg som skapats av sekventiell fånga SpectrumOrange med hjälp av en TexasRed och en SpectrumGold filter).

En sond som innehåller tre prober, specifikt för centromer regioner i X-och Y-kromosomer och en autosome, rekommenderas för könsbestämning (14), den autosomal sonden används för att upprätta ploidi och därmed att skilja mellan trisomi X (2n, 47 , XXX) och triploidy 3n (, 69, XXX) och mellan tetrasomy X 48 (, XXXX) och tetraploidy 4N (, 92, XXXX). En typisk sond som tillämpas i denna inställning är Abbott AneuVysion blandning som innehåller alfa-satellit-X, Y och 18, denna givare som har visat sig ha en mycket låg polymorfism takt, och därför förbehandling upparbetning av reproduktiv partner krävs inte (14).

Sonden blandning för någon speciell ombildning bör helst innehålla sonder åtminstone tillräckligt för att upptäcka alla förväntade produkter av ombildning med kromosom obalans. Om detta inte är möjligt, blandar sond där oupptäckt obalanserade produkter har bedömts vara icke livskraftiga i en igenkännbar graviditet och har sannolikt mycket låg förekomst kan vara acceptabelt (14). Testas på odlade lymfocyter metafaser från båda reproduktiva partner. Minst tio metafas sprider bör undersökas för givare specificitet, polymorfismer och cross-hybridisering, och för kromosom ombildning bärare, för att säkerställa att sonder hybridisera som väntat till olika segment av ombildning. Dessutom bör minst 100 interfas kärnor från dessa förberedelser görs för att bedöma signal specificitet, ljusstyrka och discreteness (14).

Commercial PGS sond uppsättningar finns tillgängliga (t.ex. Abbott MultiVysion PB eller PGT), med inriktning på kromosomerna som oftast visar sig vara aneuploid i produkter av befruktningen, och som består av en ensam sond per kromosom riktade. Typiskt kärnan kan ha en andra hybridisering med sonder för extra kromosomer ger en assay för kromosomerna 13, 15, 16, 18, 21, 22, och XY (14). Det prediktiva värdet för denna test med att sprida och FISH teknik som beskrivs här är sannolikt att oacceptabelt låga i de flesta människors händer och det rekommenderas inte för rutinmässig klinisk användning (7, 15).

Tekniker såsom jämförande genomik hybridisering (CGH) tillämpas på enstaka celler kan testa för det antal kopior av varje kromosom (Wilton et al. 2001), och användning av single nucleotide polymorphisms (SNP) arrayer och kvantitativ analys (Wells et al . 2008) eller "karyomapping" genotypning (Handyside et al. 2009) är lovande alternativa tekniker för att upptäcka kromosom aneuploidi. Men upplösningen gränsen och noggrannhet för segmentet obalans fortfarande osäkra och det är troligt att fisk kommer att fortsätta vara den teknik val för kromosom omdisponeringar omfattar små segment.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Hydrochloric Acid, 2.5L		VWR	101254H
Sodium Chloride, 5Kg		VWR	443827W
Potassium Chloride, 250g		VWR	26764.232
di-Sodium Hydrogen Orthophosphate Anhydrous, 500g		VWR	102494C
Potassium Dihydrogen Orthophosphate, 500g		VWR	10203 4B
Sodium Hydroxide Pellets, 500g		VWR	28245.265
Tween20, 500mL		VWR	663684B
Ethanol, 2.5L		VWR	8.18760.2500	Duty Paid
Tri-Sodium Citrate, 5Kg		VWR	27833.363
Cow Gum, 250mL		Cow Proofings Ltd.	No longer available	Old stocks can still be found in art shops
DAPI/Antifade ES, 0.125μg/mL, 500ul		Cytocell	DES500L	150μl vial rec’d with each Cytocell TEL Probe
Nail Varnish, 12mL		Boots	10088316001
Amine-coated Slides, 25		Genetix	K2615
DAPI, 0.1mL		Sigma-Aldrich	D-9542
Vectashield, 10mL		Vector Laboratories	H1000
Texas-Red-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2016
FITC-avidin, 0.001mL		Vector Laboratories	A-2011
Cy-5 Streptavidin, 0.001mL		GE Healthcare	PA45001
Microcentrifuge Tubes, 1.75mL, box of 500		Thistle Scientific	AX-MCT-175-C
Microcentrifuge Tubes, 0.6mL, box of 1000		Thistle Scientific	AX-MCT-060-C-CS
30ml Universal Containers, box of 400		Sterilin	128B	Available from NHS Supply Chain, Cat No. KCP053
Hot Block
Spirit Burner Spirit Burner Socket Spirit Burner Wick		VWR VWR VWR	451-0107 451-3112 451-3111
Plugged Glass Pipettes		Fisher Scientific	PMK-300-052R
Dissecting Microscope		Wild Heerbrugg
Tissues, 100boxes		NHS SUPPLY CHAIN	MJT058
Metal Culture Trays
Plastic Melamine Trays		VWR	682-009
Oven
Mouth Pipette Mouthpiece		Scientific Laboratory Supplies	HAE3700
Tubing
Syringe Filter, 0.2μm pore size, 25mm diameter		Fisher Scientific	FDM-340-010U
Diamond Pen		VWR	818-0021
Hot Block for Slides		Thermo Hybaid	HBOSBB
Hybridization Chamber
Tissue Roll		NHS SUPPLY CHAIN	MJT004
Schieferdecker Jar		VWR	631-9313
Coplin Jar		VWR	631-9331
Forceps, Fine		VWR	232-2123
Forceps, Blunt		VWR	232-2113
1000mL Beaker		VWR	213-1642
Phase Contrast Microscope		Nikon	E200
Fibre-free Blotting Cards, box of 100		Fisher Scientific (Raymond Lamb)	SDE1
Blue-Frosted Microscope Slides, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3022
Coverslips, 18x18mm, No. 1, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3110
Coverslips, 22x22mm, No. 0, box of 200		Scientific Laboratory Supplies	MIC3104
Coverslips, 22x50mm, No. 0, box of 100		Scientific Laboratory Supplies	MIC3206
1mL Syringe, box of 100		NHS Supply Chain	FWC045
1mL Pipette Tip, 10racks of 1000		Thistle Scientific	AX-T-1000-C-L-R
Incubator		LEEC
Waterbath		Grant	W22
Alcohol Thermometer				Various sources available
pH Meter		Jenway	3305
pH Electrode		VWR	662-1759	BNC Plug to fit Jenway pH meter 3305
Heated Stirrer		Bibby	HC502
1mL Pasteur Pipettes, box of 500		Scientific Laboratory Supplies	PIP4202
Parafilm, 50mm x 75m		VWR	291-1214