Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.
Dynamische veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in reactie op verschillende stimuli reguleert vele cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en apoptose 1. Tijdens apoptose, calcium ophoping in mitochondriën stimuleert het vrijkomen van pro-apoptotische factoren uit de mitochondriën in het cytosol 2. Het is daarom van belang om mitochondriale calcium rechtstreeks te meten in levende cellen in situ tijdens de apoptose. Hoge-resolutie fluorescerende beeldvorming van cellen geladen met dual-excitatie ratiometrische en niet-ratiometrische synthetische calcium indicator kleurstoffen heeft bewezen een betrouwbare en veelzijdige tool om de verschillende aspecten van de intracellulaire calcium signaaloverdracht studie. Het meten van cytosolische calcium fluxen met behulp van deze technieken is relatief eenvoudig. Echter, het meten van intramitochondrial calciumspiegels in intacte cellen met behulp van synthetische calcium indicatoren, zoals Rhod-2 en Rhod-FF is een grotere uitdaging. Synthetische indicatoren gericht op de mitochondriën zijn afgestompte reacties op herhaalde toename van de mitochondriale calcium, en verstoren mitochondriale morfologie 3. Bovendien, synthetische indicatoren hebben de neiging om uit te lekken van mitochondriën gedurende enkele uren waardoor ze ongeschikt zijn voor de lange termijn experimenten. Zo zijn genetisch gecodeerd calcium indicatoren die gebaseerd zijn op groen fluorescerend eiwit (GFP) 4 of 5 aequorine gericht op de mitochondria aanzienlijk vergemakkelijkt het meten van de mitochondriale calcium dynamiek. We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het real-time meting van mitochondriale calcium fluxen in reactie op verschillende stimuli. De methode is gebaseerd op fluorescentie microscopie van 'ratiometrische-pericam', die selectief is gericht op mitochondriën. Ratiometrische pericam is een calcium-indicator gebaseerd op een fusie van circulair gepermuteerd geel fluorescerend eiwit en calmodulin 4. Binding van calcium aan ratiometrische pericam veroorzaakt een verschuiving van de excitatie piek van 415 nm tot 494 nm, terwijl de emissie spectrum, dat pieken rond 515 nm, blijft ongewijzigd. Ratiometrische pericam bindt een calcium-ion met een dissociatieconstante in vitro van ~ 1,7 uM 4. Deze eigenschappen van ratiometrische pericam kan de kwantificering van een snelle en lange-termijn veranderingen in de mitochondriale calcium concentratie. Daarnaast beschrijven we de aanpassing van deze methodologie op een standaard wide-field calcium imaging microscoop met algemeen beschikbare filter sets. Met behulp van twee verschillende agonisten, de purinerge agonist ATP en apoptose-inducerende geneesmiddelen staurosporine, tonen we aan dat deze methode geschikt is voor het monitoren van veranderingen in het mitochondriale calcium concentratie met een temporele resolutie van seconden tot uren. Verder hebben we ook laten zien dat ratiometrische pericam ook nuttig is voor het meten van mitochondriale kernsplijting / fragmentatie tijdens apoptose. Zo is ratiometrisch pericam bijzonder goed geschikt voor continue lange termijn meting van mitochondriale calcium dynamiek tijdens apoptose.
Hier presenteren wij een zeer eenvoudige methode voor het meten van mitochondriale calcium met behulp van mitochondriaal-gerichte ratiometrische pericam. Zoals weergegeven in Figuur 1A, met behulp van standaard groothoek optiek met geen deconvolutie is het mogelijk om gemakkelijk de individuele mitochondria bekijken in HeLa cellen met acceptabele signaal-ruisverhouding. Dit komt omdat HeLa cellen, zoals de meeste cellen in cultuur, significant plat wanneer aanhanger wegnemen van de noodzaak voor confocale microscopie of andere gespecialiseerde apparatuur. Wij hebben gevonden soortgelijke resultaten in Jurkat cellen gehandeld op grond van poly-lysine gecoate dekglaasjes 8. In tegenstelling tot de methodes met behulp van kleurstoffen, is het ook mogelijk om niet-invasieve mitochondriale calcium-monitor voor uren gebruik van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals ratiometrische pericam (figuur 1E). Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van mitochondriale calcium tijdens celdood. Bovendien is het ook mogelijk om kernsplijting / fragmentatie van mitochondria visualiseren tijdens het apoptotische proces. Zoals in de figuren 1D en E, staurosporine behandeling veroorzaakt een langzame toename van de calcium in bepaalde subpopulaties van de mitochondriën, die pieken op 20 minuten. Calciumgehalte gaan weer met mitochondriale fragmentatie gelijktijdig voordat je weer twee uur na de behandeling. Dit is consistent met de langzame golven in cytosol veroorzaakt door calcium gemeten staurosporine behandeling met behulp van Fura-2 9. Zo kunnen belangrijke kinetische informatie worden verkregen die niet mogelijk is met methoden gebruik statische metingen. Hoewel we hebben gepresenteerd ratio's en niet calcium concentraties in figuur 1, is het mogelijk om de sensor te kalibreren in situ van absolute calcium niveau 4, 10 te berekenen. Een belangrijk voorbehoud om te overwegen is dat ratiometrisch pericam is gevoelig voor pH 4, 10. Omdat zowel de cytosolische en mitochondriale pH-waarde kan drastisch veranderen tijdens apoptosis 11, is dit een belangrijke overweging. Titratie van de pH in geïsoleerde mitochondria uiten pericam aan te tonen dat een verhoging van [H +] verhoogt de uitstoot van pericam toen opgewonden 495 nm, met weinig effect op de uitstoot gestimuleerd wordt door excitatie bij 410 nm, een woning die is benut om gelijktijdig meten van zowel de mitochondriale calcium en pH 12. Zo selectief controle emissie met 410 nm excitatie biedt een middel om niet-ratiometrically monitoren mitochondriale calcium met een verminderde zorg voor de pH. Ten slotte is het protocol hier gepresenteerde vereist alleen toegang tot een standaard epifluorescerende microscoop met op grote schaal beschikbaar filters, waardoor deze techniek toegankelijk voor de meeste laboratoria.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Atsushi Miyawaki bedanken voor het verstrekken van ons de ratiometrische-pericam-mt expressie-construct. Dit werk werd ondersteund door subsidie GM081685 van de National Institutes of Health (DB).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |