يتم فرضه التلاعب الجيني عديدة و / أو الحقن intramyocardial من الجينات والبروتينات ، والخلايا ، و / أو المواد الحيوية على البعد من الوقت في دراسة إصابات نقص التروية / ضخه الحادة والمزمنة في إعادة عرض الفئران. هذا الفيديو يوضح الإجراءات المجهرية لنقص التروية / ضخه دائمة ربط الشريان التاجي ، والدراسات intramyocardial الحقن.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
أمراض القلب والشرايين لا تزال تشكل وبائية وماليا كبيرا مشكلة صحية عامة. لا تزال هناك حاجة كبيرة البحوث الأساسية لفهم الآليات التي من الإصابات وإعادة تشكيل وكيفية المضي قدما العلاجات المحتملة قد تعدل هذه العمليات إذا أريد لها أن تكون المتقدمة للاستخدام السريري. هي الأكثر شيوعا القوارض ومجموعة واسعة من الفئران المعدلة وراثيا يجعل من هذه الأنواع المتاحة نموذج أكثر جاذبية.
على الرغم من أن هناك اختلافات بين الفئران والأنواع الأخرى ، وهناك العديد من المزايا لنموذج الفئران. استخدام نطاق بسيط تشريح أو العدسة المكبرة ومضاءة جيدا ظروف تمكن من الأوعية الدموية بسهولة أن ينظر إليه (لتشريح تفصيلي لإجمالي الأوعية الدموية ، راجع سالتو تيليز ، وآخرون ، 2004 13). للحد من مخاطر وفيات بعد العمليات الجراحية ، من المهم جدا لتجنب قطع السفن الكبيرة منذ حجم الدم الكلي للماوس 25G أقل من 14 2ml. في حال حدوث نزيف حاد ، يمكن استخدام تطبيق لطيف الضغط أو الكي تحديد لوقف النزيف.
ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذا الإجراء في مجموعة متنوعة من الطرق. على سبيل المثال ، يمكن أن الفئران باستخدام تخدير isoflurane ، الكيتامين / زيلازين ، أو الصوديوم بنتوباربيتال ويتم تحديد الاختيار المناسب لمدة البروتوكول 15-18. منعكس في إصبع القدم قرصة هو المؤشر الأكثر استخداما لعمق التخدير. كذلك ، من أجل تحسين احتمال البقاء على قيد الحياة لمدة طويلة ، وبعض المحققين استخدام العقاقير مثل ارتفاع معدل ضربات القلب يدوكائين للحد من حالات عدم انتظام ضربات القلب المميتة من 19،20 ومع ذلك ، يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه قد تم مؤخرا أظهرت أن هذه الخصائص في antiapoptotic حادة نموذج 21. أيضا ، للحد من الألم بعد الجراحة ، يمكن أن تدار مثل المسكنات البوبرينورفين لأول 48 ساعة بعد الجراحة 3،16،17،22،23. للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة (وخاصة لفترة أطول بروتوكولات) ، وكثيرا ما يستخدم مسبار المستقيم في سلسلة مع وسادة التدفئة في المكان لوحة متساوي. لنقص التروية / ضخه و / أو قبل أو نقص تروية postconditioning : يمكن تغيير مدة إطباق (ق) وضخه (ق) ؛ ؛ لانسداد دائم ، ويمكن تعديل حجم احتشاء بتعديل موقع ضمد وحقن intramyocardial (خلايا مثلا ، والبروتينات) ، ويمكن أن تكون هناك أماكن الحقن 1-3 وحجم الواحد الحقن يمكن أن تصل إلى 15 24 ميكرولتر. إذا كان يتم حقن الخلايا ، وهو المقياس من الإبرة المستخدمة (26-30 عادة) وينبغي اختيار 5،25،26 استنادا إلى حجم الخلايا بحيث القطر الداخلي للإبرة كبيرة بما يكفي لتجنب sheering. لتجنب يفند بسبب العمليات الالتهابية الناجمة عن الجراحة ، وأفاد بعض المحققين باستخدام الفخ الذي يتلاعب فيفو السابقين لتسد وreperfuse في قلوب ماوس الصدر يغلق عند أي نقطة 27-29 بعد الجراحة. في الآونة الأخيرة ، وغاو وآخرون (30). أظهرت أنه لا يمكن أن يؤديها انسداد مؤقت ودائم من دون الحاجة للتهوية ومختبرات قليلة قد بدأت في استخدام الموجات فوق الصوتية لأداء المغلقة الصدر intramyocardial الحقن 25،31.
منذ نشر أول دراسة تثبت جدوى ligating الشريان التاجي في الفئران عن طريق جونز وأولسون في عام 1954 32 ، وقد اعتمدت العديد من الآخرين على هذا النموذج وتعديله لدراسة الجوانب المختلفة لإصابة عضلة القلب وإعادة عرض 3،33-45. طبيعة الفئران من حيث الحجم ، والقدرة على الإنجاب ، وحساب أقل نسبيا لشراء وصيانة جعل هذه الأنواع وسيلة جذابة لمجموعة واسعة من الدراسات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. كما التصغير التكنولوجيا من أجل التصوير في فيفو التقدم 46-49 ، فضلا عن وسائل لتنفيذ وتحليل الجينوم والبروتيوميات نطاق واسع ، وفحص المخدرات وفعالية من العلاجات المستندة إلى الخلايا و / أو البروتين وكذلك الحيوية 50-64 ، جنبا إلى جنب مع طائفة واسعة على نحو متزايد من التلاعبات الجينية التي توفرها في كل مكان معين أو الفئران المعدلة وراثيا أو الأنسجة متحولة / خروج المغلوب ، وهذا النموذج من الفئران احتشاء عضلة القلب مما لا شك فيه أن يستمر أداة لا تقدر بثمن في تقييم الإصابات القلبية الحادة وإعادة عرض على المدى الطويل. لذلك ، هناك قيمة لا يرقى إليه الشك في أن تكون قادرة على تنفيذ هذه التجارب بشكل موثوق وبتكاثر.
The authors have nothing to disclose.
وأود أن أنوه إدارة البحوث والدراسات العليا لتوفير الأموال اللازمة لدعم بحثي ودائرة الطب المقارن ليقظتها والمساعدة. وأود أيضا أن تعترف وزارة فسيولوجيا لما قدموه من دعم وتوجيه وكذلك الطلاب والفنيين في المختبر بلدي لمساعدتهم. أخيرا ، أود أن أشكر لي بعد الدكتوراه معلمه ، والدكتور تشارلز إي المري ، لإتاحة الفرصة للتدريب خلال الوقت الذي تعلمت المجهرية الماوس.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |