Tal van genetische manipulaties en / of intramyocardial injecties van genen, eiwitten, cellen en / of biomaterialen wordt toegevoegd aan de dimensie van de tijd in studies van de acute ischemie / reperfusie schade en chronische remodeling bij muizen. Deze video illustreert de microchirurgische procedures voor ischemie / reperfusie, permanent coronaire ligatie, en intramyocardial injectie studies.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
Hart-en vaatziekten nog steeds een epidemiologisch en fiscaal groot probleem voor de volksgezondheid. Veel fundamenteel onderzoek is nog steeds nodig om de mechanismen die letsel en remodeling te gaan en hoe met eventuele therapie kunnen moduleren deze processen als ze worden ontwikkeld voor klinisch gebruik te begrijpen. Knaagdieren worden het meest gebruikt en het brede scala van genetisch gemodificeerde muizen ter beschikking stelt deze soort een aantrekkelijker model.
Hoewel er verschillen zijn tussen muizen en andere soorten, zijn er veel voordelen aan een muismodel. Het gebruik van een eenvoudige ontleding scope of vergrootglas en goed verlichte omstandigheden kan de vasculatuur gemakkelijk te kunnen zien (voor gedetailleerde anatomie van de bloedvaten, zie Salto-Tellez et al.., 2004 13). Om het risico van postoperatieve sterfte, is het zeer belangrijk om te voorkomen dat verbreken van grote schepen, omdat het totale bloedvolume van een 25g muis is minder dan 2 ml 14. In het geval dat overmatig bloeden optreedt, kan de toepassing van lichte druk of lokaliseren cauterisatie gebruikt worden om het bloeden te stoppen.
Deze procedure kan ook worden gewijzigd in een verscheidenheid van manieren. Kan bijvoorbeeld muizen worden verdoofd met behulp van isofluraan, ketamine / xylazine of natriumpentobarbital en de juiste selectie wordt bepaald door de duur van het protocol 15-18. De teen-pinch reflex is de meest gebruikte index van de diepte van de anesthesie. Verder, om de waarschijnlijkheid voor de lange termijn te overleven te verbeteren, sommige onderzoekers gebruik van anti-aritmica zoals lidocaïne om de incidentie van dodelijke aritmieën 19,20 echter, moet rekening worden gehouden dat dit recent is aangetoond dat het antiapoptotic eigenschappen te hebben in een acute vermindering van model 21. Ook voor post-operatieve pijn te verminderen, kunnen pijnstillers zoals buprenorfine toegediend worden voor de eerste 48 uur na de operatie 3,16,17,22,23. Te onderhouden lichaamstemperatuur tijdens een operatie (in het bijzonder voor langere protocollen), is een rectale sonde in serie met een verwarmingselement vaak gebruikt in plaats van de isotherme pad. Voor ischemie / reperfusie en / of ischemische pre-of postconditioning: de duur van de occlusie (s) en reperfusie (s) kan worden gewijzigd; voor permanente occlusie, de grootte van het infarct kan worden gewijzigd door het aanpassen van de locatie van de ligature; en voor intramyocardial injecties (bijv. cellen, eiwitten), kan er 1-3 injectie locaties en het volume per injectie kan oplopen tot 15 ui 24. Als cellen worden geïnjecteerd, de graadmeter voor de naald gebruikt (meestal 26-30) 5,25,26 moet worden gekozen op basis van de grootte van de cellen, zodat de inwendige diameter van de naald is groot genoeg om te voorkomen dat Sheering. Om te voorkomen dat verwart als gevolg van ontstekingsprocessen veroorzaakt door de operatie hebben sommige onderzoekers gemeld met behulp van een strik, dat is gemanipuleerd ex vivo om af te sluiten en de harten in een gesloten kist muis reperfuse op enig moment na de operatie 27-29. Meer recent, Gao et al.. Dertig hebben aangetoond dat tijdelijke en permanente occlusie kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak voor ventilatie en een paar laboratoria zijn begonnen met echografie te gebruiken om een gesloten kist intramyocardial injecties 25,31 uit te voeren.
Sinds de eerste studie tonen de haalbaarheid van ligeren van de kransslagader bij muizen werd gepubliceerd door Johns en Olson in 1954 32, hebben vele anderen die dit model en aangepast aan de verschillende aspecten van het myocard letsel en remodeling 3,33-45 studie. De aard van muizen in termen van grootte, reproductieve capaciteit, en relatief minder kosten voor aanschaf en het onderhoud maken deze soort een aantrekkelijk instrument voor een breed scala aan fysiologische en pathofysiologische studies. Als de miniaturisering van de technologie voor imaging in vivo vooruitgang 46-49, maar ook als middel om uit te voeren en op grote schaal genomica en proteomica, drug discovery, de doeltreffendheid van cel-gebaseerde en / of eiwit therapieën als biomaterialen 50-64 jaar, gecombineerd analyseren met de steeds brede waaier van genetische manipulaties wordt geboden door alomtegenwoordig of weefsel specifieke transgene of mutant / knock-out muizen, zal het muizenmodel van myocardinfarct zonder twijfel nog steeds een instrument van onschatbare waarde bij het evalueren van acute cardiale letsels en lange termijn remodelleren worden. Daarom is er onmiskenbare waarde in het zijn in staat om deze experimenten uit te voeren betrouwbaar en reproduceerbaar.
The authors have nothing to disclose.
Ik zou graag aan de afdeling Research en Graduate Studies erkennen voor het verstrekken van fondsen aan mijn onderzoek en de Vakgroep Vergelijkende Geneeskunde steun voor hun waakzaamheid en hulp. Ik zou ook graag de afdeling Fysiologie voor hun steun en begeleiding, alsook de studenten en technici in mijn lab te erkennen voor hun hulp. Tot slot wil ik mijn post-doctorale mentor, Dr Charles E. Murry, bedanken voor de opleiding te worden in die tijd leerde ik de muis microchirurgie.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |