Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
Koronare Herzkrankheit weiterhin ein epidemiologisch und steuerlich erhebliche Problem der öffentlichen Gesundheit werden. Erhebliche Grundlagenforschung ist noch nötig, um die Mechanismen, durch die Verletzung und den Umbau vor und wie potenzielle Therapeutika modulieren kann diese Prozesse, wenn sie für den klinischen Einsatz entwickelt werden, zu verstehen. Nagetiere werden am häufigsten verwendet und die breite Palette von genetisch veränderten Mäusen zur Verfügung stellt, diese Art ein attraktives Modell.
Obwohl es Unterschiede zwischen Mäusen und anderen Tierarten, es gibt viele Vorteile zu einem Mausmodell. Verwenden eines einfachen Binokular oder Lupe und gut beleuchtet Bedingungen ermöglichen das Gefäßsystem zu leicht zu erkennen (für detaillierte makroskopischen Anatomie des Gefäßsystems, siehe Salto-Tellez et al., 2004 13). Um das Risiko von post-operative Sterblichkeit, ist es sehr wichtig, um zu vermeiden Durchtrennung großer Gefäße, da die gesamte Blutvolumen eines 25g Maus ist weniger als 2 ml 14. Für den Fall, dass eine übermäßige Blutungen auftreten, können sanfte Anwendung von Druck oder stecknadelkopfgroße Verätzungen verwendet werden, um die Blutung zu stoppen.
Dieses Verfahren kann auch in einer Vielzahl von Arten modifiziert werden. Zum Beispiel können Mäuse betäubt werden mit Isofluran, Ketamin / Xylazin oder Natrium-Pentobarbital und entsprechende Auswahl wird durch die Dauer des Protokolls 15-18 bestimmt. Die Zehen Prise Reflex ist das am häufigsten verwendete Index der Tiefe der Anästhesie. Weitere, um die Wahrscheinlichkeit für das langfristige Überleben zu verbessern, verwenden einige Forscher Antiarrhythmika wie Lidocain, um die Inzidenz von tödlichen Arrhythmien 19,20 es jedoch zu berücksichtigen, dass dieser vor kurzem wurde gezeigt, dass antiapoptotischen Eigenschaften in eine akute haben reduzieren Modell 21. Auch, um postoperative Schmerzen zu reduzieren, können Schmerzmittel wie Buprenorphin für die ersten 48 Stunden nach der Operation 3,16,17,22,23 verabreicht werden. Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur während der Operation (vor allem für längere Protokolle), ist eine rektale Sonde in Reihe mit einem Heizkissen oft an die Stelle der isothermen Pad verwendet. Für Ischämie / Reperfusion und / oder ischämische Prä-oder postconditioning: die Dauer der Okklusion (s) und Reperfusion (s) können verändert werden; für die permanente Okklusion, die Größe des Infarktes kann durch Einstellen der Lage der Ligatur geändert werden; und für intramyokardialen Injektionen (zB Zellen, Proteine), kann es 1-3 Injektionsstellen werden und das Volumen pro Injektion kann bis zu 15 ul 24. Wenn Zellen injiziert wird, verwendet der Feinheit der Nadel (in der Regel 26-30) 5,25,26 basierend auf der Größe der Zellen sollte so gewählt werden, der Innendurchmesser der Nadel ist groß genug, um zu vermeiden Scheeren. Um zu vermeiden, verwirrt durch entzündliche Prozesse durch die Operation ausgelöst haben einige Forscher berichteten über eine Schlinge, die ex vivo zu verschließen und reperfuse die Herzen in einem geschlossenen Kasten mit der Maus an einer beliebigen Stelle nach der Operation 27-29 manipuliert wird. In jüngerer Zeit Gao et al. 30 haben gezeigt, dass temporäre und permanente Okklusion ohne die Notwendigkeit für die Belüftung durchgeführt werden kann und ein paar Labors haben damit begonnen, Ultraschall verwenden, um bei geschlossener Brust intramyokardialen Injektionen 25,31 auszuführen.
Seit der ersten Studie demonstriert Machbarkeit der Ligation der Koronararterie in Mäusen wurde von Johns und Olson 1954 32 Erscheinungsweise, viele andere dieses Modell übernommen und modifiziert sie, um verschiedene Aspekte der myokardialen Verletzungen und Umbau 3,33-45 studieren. Die Art von Mäusen in Bezug auf Größe, Fortpflanzungsfähigkeit, und vergleichsweise weniger Aufwand für Anschaffung und Wartung machen diese Art ein ansprechendes Werkzeug für ein breites Spektrum von physiologischen und pathophysiologischen Studien. Da die Miniaturisierung von Technologie für die Bildgebung in vivo Fortschritte 46-49, sowie Mittel zur Durchführung und Analyse von großen Maßstab Genomik und Proteomik, Wirkstoff-Screening, die Wirksamkeit der Zell-und / oder Protein-Therapien sowie Biomaterialien 50-64, kombiniert mit der zunehmend breite Palette von genetischen Manipulationen durch ubiquitäre oder Gewebe spezifische transgene oder Mutanten / Knockout-Mäusen ergab, wird die Maus-Modell des Myokardinfarkts zweifellos auch weiterhin ein unverzichtbares Werkzeug in die Bewertung der akuten kardialen Verletzungen und langfristigen Umbau werden. Deshalb gibt es unbestreitbaren Wert in der Lage, diese Experimente zuverlässig und reproduzierbar durchführen.
The authors have nothing to disclose.
Ich möchte die Abteilung Forschung und Graduate Studies für die Bereitstellung von Mitteln, um meine Forschungen und die Abteilung für Vergleichende Medizin für ihre Wachsamkeit und Hilfe zu unterstützen anzuerkennen. Ich möchte auch an das Department of Physiology für ihre Unterstützung und Beratung sowie die Studenten und Techniker in meinem Labor für ihre Hilfe erkennen. Schließlich möchte Ich mag meine Post-Doc-Mentor, Dr. Charles E. Murry, für die Ausbildung die Möglichkeit, während der Zeit lernte ich die Maus Mikrochirurgie danken.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |