Numerose manipolazioni genetiche e / o iniezioni intramiocardiche di geni, proteine, cellule e / o biomateriali si sovrappongono la dimensione del tempo negli studi di acuta ischemia / riperfusione e rimodellamento cronica nel topo. Questo video illustra le procedure di microchirurgia per ischemia / riperfusione, permanente legatura delle arterie coronarie, e gli studi di iniezione intramiocardico.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
Malattia coronarica continua ad essere un epidemiologico e fiscalmente rilevante problema di sanità pubblica. Notevole la ricerca di base è ancora necessaria per capire i meccanismi con cui lesioni e rimodellamento procedere e come potenziali terapie possono modulare questi processi, se si vuole essere sviluppate per uso clinico. Roditori sono più comunemente utilizzati e la vasta gamma di topi geneticamente modificati, rende disponibile questa specie un modello più attraente.
Anche se ci sono differenze tra topi e altre specie, ci sono molti vantaggi a un modello murino. L'uso di un ambito semplice dissezione o lente d'ingrandimento e condizioni ben illuminata per consentire la vascolarizzazione facilmente essere visto (per informazioni dettagliate anatomia del sistema vascolare, vedere Salto-Téllez et al., 2004 13). Per ridurre il rischio di mortalità post-operatoria, è molto importante evitare di recidere vasi di grandi dimensioni in quanto il volume totale del sangue di un topo 25g è inferiore a 2 ml 14. In caso di eccessivo sanguinamento si verifica, l'applicazione delicata di pressione o cauterizzazione individuare può essere usato per fermare l'emorragia.
Questa procedura può anche essere modificata in diversi modi. Per esempio, i topi possono essere anestetizzati con isoflurano, ketamina / xylazina, o sodio pentobarbital e un'adeguata selezione è determinata dalla durata del protocollo 15-18. La punta pizzico riflesso è l'indice più utilizzato della profondità dell'anestesia. Inoltre, per aumentare la probabilità di sopravvivenza a lungo termine, alcuni ricercatori utilizzano farmaci antiaritmici, come lidocaina per ridurre l'incidenza di aritmie letali 19,20 però, si deve tener conto che questo è stato di recente dimostrato di avere proprietà antiapoptotiche in un acuto modello 21. Inoltre, per ridurre il dolore post-operatorio, analgesici come la buprenorfina può essere somministrato per le prime 48 ore dopo l'intervento 3,16,17,22,23. Per mantenere la temperatura corporea durante l'intervento chirurgico (soprattutto per i più protocolli), una sonda rettale in serie con una piastra elettrica è spesso usato al posto del pad isotermici. Per ischemia / riperfusione e / o pre-ischemico o postconditioning: la durata dell'occlusione (s) e riperfusione (s) può essere modificata, per occlusione permanente, la dimensione dell'infarto può essere modificato regolando la posizione della legatura; e per le iniezioni intramiocardiche (es. cellule, proteine), ci possono essere posizioni di iniezione 1-3 e il volume per iniezione può essere fino a 15 microlitri 24. Se le cellule vengono iniettate, il calibro dell'ago utilizzato (di solito 26-30) 5,25,26 deve essere scelto in base alle dimensioni delle celle in modo che il diametro interno dell'ago è grande abbastanza per evitare Sheering. Per evitare confonde a causa di processi infiammatori innescati da l'intervento, alcuni ricercatori hanno riferito di usare una trappola che viene manipolato ex vivo per occludere e reperfuse il cuore in petto un topo chiuso in qualsiasi momento dopo l'intervento chirurgico 27-29. Più recentemente, Gao et al. 30 hanno dimostrato che l'occlusione temporanea e permanente può essere eseguito senza la necessità di ventilazione e di alcuni laboratori hanno iniziato ad utilizzare gli ultrasuoni per eseguire chiuso petto intramiocardico iniezioni 25,31.
Dal momento che il primo studio che dimostrano la fattibilità di legatura dell'arteria coronarica nei topi è stato pubblicato da Johns e Olson nel 1954 32, molti altri hanno adottato questo modello e modificato per studiare vari aspetti del danno miocardico e rimodellamento 3,33-45. La natura di topi in termini di dimensioni, capacità riproduttiva, e relativamente meno spese per l'acquisto e la manutenzione rendono questa specie uno strumento interessante per una vasta gamma di studi fisiologici e fisiopatologici. Come la miniaturizzazione della tecnologia per l'imaging in vivo degli anticipi 46-49, così come mezzo per eseguire ed analizzare su larga scala genomica e proteomica, screening di farmaci, l'efficacia di terapie basate sulle cellule e / o di proteine così come biomateriali 50-64, combinato con la gamma sempre più ampia di manipolazioni genetiche offerta da topi specifiche ubiquitaria o tessuto transgenici o mutanti / eliminazione diretta, il modello murino di infarto miocardico senza dubbio continuerà ad essere uno strumento prezioso nella valutazione lesione acuta rimodellamento cardiaco e lungo termine. Pertanto, non vi è valore indiscutibile di essere in grado di effettuare questi esperimenti in modo affidabile e riproducibile.
The authors have nothing to disclose.
Vorrei ringraziare il Dipartimento di Ricerca e Studi Laurea per fornire fondi per sostenere la mia ricerca e del Dipartimento di Medicina comparativa per la vigilanza e l'assistenza. Vorrei anche a riconoscere il Dipartimento di Fisiologia per il loro sostegno e la guida così come gli studenti e tecnici nel mio laboratorio per il loro aiuto. Infine, vorrei ringraziare il mio post-dottorato mentore, il Dr. Charles E. Murry, per l'opportunità di formazione durante i quali ho imparato il microchirurgia del mouse.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |