多数の遺伝子操作及び/または遺伝子、タンパク質、細胞、および/または生体物質の心筋内注射は、急性虚血/再灌流傷害およびマウスにおける慢性的リモデリングの研究に時間の次元に重ね合わされている。このビデオでは、虚血/再灌流、恒久的な冠動脈結紮、および心筋内注入の研究のための顕微手順を示しています。
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
冠状動脈性心臓病の疫学的および財政的に重要な公衆衛生上の問題であり続けている。かなり基本的な研究はまだ怪我して改造を続行するメカニズムとそれらがどのように臨床使用するために開発される場合に潜在的な治療法はこれらのプロセスを調節することを理解するのに必要です。げっ歯類は、最も一般的に使用され、遺伝子改変マウスの広い範囲が利用可能なこの種のより魅力的なモデルになりますされています。
マウスや他の種の違いがありますが、マウスモデルに多くの利点があります。簡単な解剖スコープまたは虫眼鏡を使用しても点灯条件は、血管を容易に見ることができるようになります(血管系の詳細な肉眼解剖学のために、サルト- Tellez らを参照してください。、2004 13)。 25グラムのマウスの全血液量が2ミリリットル14よりも小さいので、手術後の死亡のリスクを減らすために、それは大型船を切断することを避けるために非常に重要です。過度の出血が発生した場合には、圧力やピンポイントの焼灼の穏やかなアプリケーションは、出血を止めるために使用することができます。
この手順は、さまざまな方法で変更することができます。例えば、マウスは、イソフルラン、ケタミン/キシラジン、またはペントバルビタールナトリウムと適切な選択はプロトコル15から18までの期間によって決定されるを使用して麻酔することができます。つま先-ピンチの反射は麻酔の深さの最も一般的に使用されるインデックスです。さらに、長期生存の確率を向上させるために、いくつかの研究者が致死性不整脈19,20の発生率を減らすためにリドカイン等の抗不整脈薬を使用するしかし、それは、これは最近、急性の抗アポトーシス特性を有することが示されていることを考慮する必要があります。モデル21。また、手術後の痛みを軽減する、そのようなブプレノルフィンなどの鎮痛薬は、手術3,16,17,22,23後の最初の48時間に投与することができる。 (特に長いプロトコルのため)手術中の体温を維持するために、加熱パッド付きシリーズの直腸プローブは、多くの場合、等温パッドの代わりに使用されます。永久的な閉塞のため、梗塞の大きさは、合字の位置を調整することによって変更されることがあります;閉塞(s)と再灌流(s)の持続時間は変更することができます:虚血/再灌流および/または虚血前またはpostconditioning用と心筋内注射(例えば、細胞、蛋白質)のために,1 – 3注射の場所が存在することができ、注入あたりの体積は15μlの24まですることができます。細胞が注入されている場合は針の内径は、シェアーリングを避けるために十分な大きさであるので、(通常は26〜30)5,25,26を使用するニードルのゲージは、細胞の大きさに基づいて選択する必要があります。手術によって引き起こされる炎症性プロセスによる困惑を避けるために、いくつかの研究者は手術27から29の後の任意の時点で閉胸のマウスの心臓を閉塞し、reperfuseにex vivoで操作されるスネアを使って報告している。さらに最近では、ガオら 30は、一時的および永久的な閉塞が換気を必要とせずに実行できると、いくつかの研究室が閉まる胸心筋内注射25,31を実行するために超音波を使用し始めていることが示されている。
マウスでは冠動脈を結紮することの実現可能性を実証する最初の研究、1954年32にジョンズとオルソンによって公開されて以来、多くの人はこのモデルを採用し、心筋障害とリモデリング3,33-45のさまざまな側面を研究するためにそれを変更しました。サイズ、生殖能力、購入とメンテナンスのため、比較的少ない費用の点でマウスの性質は、この種の生理学的および病態生理学的研究の幅広い魅力的なツールになります。 in vivoでの進歩46から49 のイメージング技術の微細化だけでなく、大規模ゲノミクスとプロテオミクスを実行し、分析することを意味し、薬剤のスクリーニング、細胞ベースおよび/ またはタンパク質の治療だけでなく、生体50から64の効果、組み合わせユビキタスまたは組織特異的トランスジェニックやノックアウト/変異マウスがもたらす遺伝子操作のますます広い範囲で、心筋梗塞のマウスモデルは、間違いなく急性心筋傷害と長期的なリモデリングを評価する上で貴重なツールであり続けるでしょう。したがって、確実にかつ再現性これらの実験を行うためにできることで疑う余地のない価値があります。
The authors have nothing to disclose.
私は彼らの警戒と支援のために私の研究と比較医学科を支援する資金を提供するための研究と大学院の専攻を感謝したい。私も彼らの助けのための支援と指導のための生理学教室だけでなく、私の研究室の学生や技術者を認識したいと思います。最後に、私はマウスのマイクロサージェリーを学習した時にトレーニングの機会のために私のポスドクのメンター、博士チャールズE.ムリーロードを、感謝したいと思います。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |