Numerosas manipulações genéticas e / ou injeções intramiocárdica de genes, proteínas, células e / ou biomateriais são sobrepostos sobre a dimensão do tempo em estudos de lesão de isquemia / reperfusão aguda e crônica em camundongos remodelação. Este vídeo ilustra os procedimentos de microcirurgia para isquemia / reperfusão, ligadura da artéria coronária permanente, e estudos de injeção intramiocárdica.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
Doença cardíaca coronária continua a ser um epidemiologicamente e fiscalmente problema de saúde pública. Pesquisa básica considerável ainda é necessária para compreender os mecanismos pelos quais lesão e remodelação proceder e como terapêutica em potencial podem modular estes processos se eles estão a ser desenvolvida para uso clínico. Roedores são mais comumente usados e da ampla gama de camundongos geneticamente modificados disponíveis torna essa espécie um modelo mais atraente.
Embora existam diferenças entre ratos e outras espécies, há muitas vantagens em um modelo murino. Uso de um escopo simples dissecação ou lupa e condições bem iluminado permitir a vasculatura para ser facilmente visto (para anatomia detalhada da vasculatura, ver Salto-Tellez et al., 2004 13). Para reduzir o risco de mortalidade pós-operatória, é muito importante para evitar a ruptura navios de grande porte desde que o volume total de sangue de um rato 25g é inferior a 2 ml 14. No caso de sangramento excessivo ocorre, a aplicação de pressão suave ou cauterização identificar pode ser usado para parar o sangramento.
Este procedimento também pode ser modificado em uma variedade de maneiras. Por exemplo, ratos podem ser anestesiados com isoflurano, ketamina / xilazina ou sódio pentobarbital e seleção apropriada é determinada pela duração do protocolo de 15-18. O reflexo toe pitada é o índice mais utilizado da profundidade da anestesia. Além disso, para melhorar a probabilidade de sobrevivência a longo prazo, alguns investigadores usam medicamentos antiarrítmicos como a lidocaína para reduzir a incidência de arritmias letais 19,20 no entanto, deve-se levar em conta que esta foi recentemente demonstrado ter propriedades anti-apoptótica em uma aguda modelo 21. Além disso, para reduzir a dor pós-operatória, analgésicos, como a buprenorfina pode ser administrada nas primeiras 48 horas após a cirurgia 3,16,17,22,23. Para manter a temperatura corporal durante a cirurgia (especialmente para os protocolos mais), uma sonda retal em série com uma almofada de aquecimento é muitas vezes usado no lugar do pad isotérmica. Para isquemia / reperfusão e / ou isquêmicos pré ou pós-condicionamento: a duração da oclusão (s) e reperfusão (s) podem ser alterados, por oclusão permanente, o tamanho do infarto pode ser modificado por ajustar a localização da ligadura; e para injectáveis intramiocárdica (células por exemplo, proteínas), pode haver locais de injeção e 03/01 o volume por injeção pode ser de até 15 24 mL. Se as células estão a ser injetado, o calibre da agulha utilizada (geralmente 26-30) 5,25,26 deve ser escolhido com base no tamanho das células de modo que o diâmetro interno da agulha é grande o suficiente para evitar sheering. Para evitar confunde devido a processos inflamatório desencadeado pela cirurgia, alguns pesquisadores têm relatado usando um laço que é manipulado ex vivo para ocluir e reperfundi os corações em um rato tórax fechado a qualquer momento após a cirurgia 27-29. Mais recentemente, Gao et al. 30 demonstraram que a oclusão temporária e permanente pode ser realizada sem a necessidade de ventilação e de alguns laboratórios começaram a usar ultra-som para realizar fechado no peito intramiocárdico injeções 25,31.
Desde o primeiro estudo a demonstrar a viabilidade da ligadura da artéria coronária em ratos foi publicado pela Johns e Olson em 1954 32, muitos outros adotaram este modelo e modificou-a para estudar vários aspectos da lesão miocárdica ea remodelação 3,33-45. A natureza de ratos em termos de tamanho, a capacidade reprodutiva, e as despesas comparativamente menos para a compra e manutenção tornam esta espécie uma ferramenta atraente para uma ampla gama de estudos fisiológicos e fisiopatológicos. Como a miniaturização da tecnologia para imagens em avanços vivo 46-49, bem como meios para executar e analisar genômica e proteômica em grande escala, a seleção da droga, a eficácia de terapias baseadas em células e / ou proteínas, bem como biomateriais 50-64, combinado com a gama crescente de manipulações genéticas oferecidas pelo onipresente ou tecidos específicos camundongos transgênicos ou mutante / knockout, o modelo murino de infarto do miocárdio, sem dúvida, continuará a ser uma ferramenta valiosa na avaliação de lesão cardíaca aguda e remodelação a longo prazo. Portanto, há um valor inquestionável em ser capaz de realizar esses experimentos de forma confiável e reprodutível.
The authors have nothing to disclose.
Gostaria de agradecer o Departamento de Pesquisa e Pós-Graduação para fornecer fundos para apoiar minha pesquisa e do Departamento de Medicina Comparativa de sua vigilância e assistência. Gostaria também de reconhecer o Departamento de Fisiologia, pelo seu apoio e orientação, bem como a estudantes e técnicos no meu laboratório por sua ajuda. Por último, gostaria de agradecer a meu mentor pós-doutoramento, Dr. Charles E. Murry, pela oportunidade de treinamento durante os quais eu aprendi a microcirurgia mouse.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |