Многочисленные генетические манипуляции и / или intramyocardial инъекции генов, белков, клеток и / или биоматериалов накладываются на измерение времени при исследовании острой ишемии / реперфузии и хронических ремоделирования у мышей. Это видео показывает, микрохирургические процедуры ишемии / реперфузии, постоянные перевязки коронарной артерии, и intramyocardial исследования инъекции.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
Ишемическая болезнь сердца по-прежнему является эпидемиологически и в финансовом отношении серьезной проблемой общественного здравоохранения. Значительные фундаментальных исследований по-прежнему необходимо, чтобы понять механизмы, посредством которых травмы и реконструкции продолжаются и, как потенциальные терапии может модулировать эти процессы, если они должны быть разработаны для клинического использования. Грызуны являются наиболее распространенным и широкий спектр генетически модифицированных мышей доступны делает этот вид более привлекательным модели.
Хотя Есть различия между мышами и другими видами, Есть много преимуществ для мышиной модели. Применение простых рассекает масштаба или увеличительное стекло и хорошо освещены условия позволяют сосудистую, чтобы легко видеть (подробное валовой анатомии сосудистой см. Сальто-Tellez и соавт., 2004 13). Чтобы уменьшить риск послеоперационных смертности, это очень важно, чтобы избежать разрыва крупных сосудов с общим объемом крови 25г мыши меньше 2 мл 14. В том случае, чрезмерное кровотечение, нежный применения давления или определить прижигание может быть использован для остановки кровотечения.
Эта процедура также может быть изменен в разному. Например, мыши могут быть под наркозом использованием изофлуран, кетамин / ксилазина, или натрия фенобарбитала и соответствующий выбор определяется длительностью 15-18 протокол. Носок-пинча рефлекс наиболее часто используемых индекс глубины наркоза. Кроме того, для повышения вероятности для долгосрочного выживания, некоторые исследователи используют антиаритмические препараты, такие как лидокаин, чтобы снизить частоту смертельных аритмий 19,20 Однако, следует учитывать, что это недавно было показано, что антиапоптотических свойства в остром Модель 21. Кроме того, чтобы уменьшить послеоперационные боли, анальгетики, такие как бупренорфин может быть введен в течение первых 48 часов после операции 3,16,17,22,23. Для поддержания температуры тела во время операции (особенно на более длительный протоколов), ректальный зонд последовательно с грелку часто используется вместо изотермических площадку. Для ишемии / реперфузии и / или ишемической до или посткондиционирование: продолжительности окклюзии (ов) и реперфузии (ы) может быть изменен, для постоянного прикуса, размер инфаркта может быть изменен путем изменения расположения лигатуры; и для intramyocardial инъекции (например, клеток, белков), не может быть 1-3 места инъекции и объема на инъекцию может быть до 15 мкл 24. Если ячейки внедряемому, датчик иглы используются (обычно 26-30) 5,25,26 следует выбирать в зависимости от размера ячеек так внутренний диаметр иглы достаточно велик, чтобы избежать Шееринг. Чтобы избежать смешивает из-за воспалительных процессов вызвано хирургии, некоторые исследователи сообщили об использовании ловушки, которые манипулируют исключая виво, чтобы закупорить и reperfuse сердца в закрытом мыши грудь в любой момент после хирургии 27-29. Совсем недавно, Гао и др. 30. Показали, что временный и постоянный прикус могут быть выполнены без необходимости вентиляции и несколько лабораторий начали использовать ультразвук для выполнения закрытой грудью intramyocardial инъекции 25,31.
С первого исследования демонстрируют возможность лигирования коронарных артерий у мышей был опубликован Джонс и Олсон в 1954 году 32, и многие другие приняли эту модель и изменение его для изучения различных аспектов повреждения миокарда и ремоделирование 3,33-45. Характер мышей с точки зрения размера, репродуктивную способность, и сравнительно меньшими затратами на приобретение и обслуживание делают этот вид привлекательным инструментом для широкого круга физиологических и патофизиологических исследований. Как миниатюризация технологии для работы с изображениями в естественных условиях 46-49 достижений, а также средства для выполнения и анализа больших масштабах геномика и протеомика, скрининга препаратов, эффективность клеточной и / или белка терапии, а также биоматериалов 50-64, в сочетании с все более широкий спектр генетических манипуляций предоставляемых повсеместно или тканей конкретного трансгенных или мутантных / нокаутом мышей, мышиной модели инфаркта миокарда, несомненно, будет продолжать быть бесценным инструментом в оценке острой сердечной травмы и длительный срок реконструкции. Таким образом, существует несомненное значение в возможности выполнения этих экспериментов надежно и воспроизводимо.
The authors have nothing to disclose.
Я хотел бы поблагодарить Департамент исследований и аспирантуры за выделение финансовых средств для поддержки своих исследований и Департамент по сравнительной медицины за бдительность и помощь. Я также хотел бы признать кафедры физиологии за их поддержку и руководство, а также студентов и техников в моей лаборатории за помощь. Наконец, я хотел бы поблагодарить моего после защиты докторской наставник, доктор Чарльз Мурри, для учебной программы в течение которых я узнал, мыши микрохирургии.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |