Härledning av thymic Lymfom T-cellinjer från Atm - / -</sup Och P53 - / -</sup Möss
Summary
I denna video visar vi ett protokoll för att upprätta mus thymic linjer lymfom cell. Genom att följa detta protokoll, har vi framgångsrikt etablerat flera T-cellinjer från ATM-/ – och p53-/ – möss med thymic lymfom.
Abstract
Etablerade cellinjer är en kritisk forskning verktyg som kan minska användningen av försöksdjur i forskning. Vissa stammar av genetiskt modifierade möss, som ATM – / – och p53 – / – utvecklar ständigt thymic lymfom tidigt i livet 1,2, och därmed kan fungera som en tillförlitlig källa för härledning av murina T-cellinjer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för utveckling av etablerade murina thymic lymfom T-cellinjer, utan att behöva lägga interleukiner som beskrivs i tidigare protokoll 1,3. Tumörer skördades från möss i åldrarna tre till sex månader, vid första tecken på synliga tumörer bygger på observationer av krökt kroppshållning, ansträngd andning, dålig grooming och slösa i en känslig stam 1,4. Vi har framgångsrikt etablerat flera T-cellinjer med hjälp av detta protokoll och inavlade stammar av ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] 2 och p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] 5 möss. Vi visar vidare att mer än 90% av de etablerade T-cells befolkningen uttrycker CD3, CD4 och CD8. I överensstämmelse med stabilt etablerade cellinjer, har T-celler som genereras med hjälp av detta protokoll har passerats i över ett år.
Protocol
Discussion
I detta protokoll, vi tillhandahåller detaljerade förfaranden för att upprätta murin T-cellinjer från två olika möss genotyper, ATM – / – [FVB/N- Atm tm1Led / J] och p53 – / – [129/S6- Trp53 tm1Tyj / J] . Genom att använda detta protokoll, totalt 6 (av 7 försök) ATM – / – och tre (av 5 försök) p53 – / – murin T-cellinjer har fastställts i vårt laboratorium. Representativa uppgifter som vi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Boris Reizis från Institutionen för mikrobiologi och immunologi vid Columbia University för bra diskussioner. Vi vill också tacka Dr Margaret Bynoe, Dr Rodman Getchell och Deequa Mahamed från institutionen för mikrobiologi och immunologi vid College of Veterinary Medicine, Cornell University för tekniskt bistånd med flödescytometri och Lu Huang för hjälp med videoredigering. Författarna vill också tacka ledamöterna i Duhamel och Weiss laboratorier för deras kritiska granskning av manuskriptet och videoproduktion, och Stephanie Yazinski från Weiss laboratoriet för avel och genotypning p53 – / – möss. Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Cornell University Institutional Animal Care och användning kommittén. Denna forskning stöds delvis av medel från US Department of Agriculture, kooperativa staten forskning, utbildning och Extension Service, djurhälsa och Disease Research Program (till GED och RSW) och NIH bidrag R03 HD058220 och R01CA108773 (till RSW). Videon producerades med hjälp av in-house anläggningar av personal från Duhamel & Weiss laboratorier.
Materials
- Ice bucket
- 70% ethanol
- Dissection pad consisting of foam block covered with aluminum foil and pins
- Two sets of small sterile scissors and forceps
- Sterile 150 mm2 Petri dish (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; cat. #08-757-13)
- Sterile 18 gauge needles
- 50 mL conical tubes (Corning Inc., Corning NY; cat # 430829)
- 10% buffered formalin
- Tissue culture flasks
- T-25 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90025)
- T-75 (TPP, Trasadingen, Switzerland; cat # 90075)
- 6-well plates (Corning Inc., Corning NY; cat # 3506)
- Sterile phosphate buffered saline pH 7.2 (PBS)
- Culture medium
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- 10% heat inactivated (56°C, 30 min) fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Logan, UT; cat# SH30088.03)
- 1% penicillin and streptomycin (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)
- 1% nonessential amino acids (Mediatech; cat#25-025-CI)
- 55 mM 2β-mercaptoethanol (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)
- RPMI 1640 with 25 mM HEPES, 200 mM L-glutamine (Lonza, Walkersville, MD; cat#12-115F) supplemented with the following:
- Dimethyl sulfoxide (DMSO; Calbiochem, La Jolla, CA; cat # 317275)
- Antibodies (eBioScience, San Diego, CA)
- anti-CD3-FITC (cat. #11-0031-85)
- anti-CD4-APC (cat. #17-0041-83)
- anti-CD8-PE (cat.#12-081-85)
- Bovine serum albumin (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; cat #. 11018-017)
- Concanavalin A (Sigma cat# C5275)
- 1.8 mL freezing vials (Nunc, Roskilde, Denmark; cat# 368632)
Riferimenti
- Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
- Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
- Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
- Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
- Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
- Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
- Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
- Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).
