Detta är ett protokoll för att förbereda och upprätthålla en hjärnbarkens skiva beredning i organotypic kulturen för att göra elektriska inspelningar från pyramidala nervceller.
Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex. På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler har vi tagit en genetisk strategi för att manipulera kanal uttryck. Vi använder en organotypic kultur förberedelse (16) för att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar vanligtvis akut hjärnbarkens skivor på postnatal dagar 8-10 och underhålla skivor i kultur för 3-7 dagar. Detta ger oss möjlighet att studera nervceller vid samma ålder med dem i vårt arbete med akut skivor och minimerar utvecklingen av översvallande excitatoriska anslutningar i segmentet. Vi spela in från visuellt identifierade pyramidformade nervceller i lager II / III eller V med hjälp av IR-belysning (IR-) och differential interferens kontrast mikroskopi (DIC) med hela cell patch clamp i ström-eller spännings-klämma. Vi använder biolistic (Gene pistol) transfektion av vildtyp eller mutant kaliumkanal DNA att manipulera uttrycket för kanalerna för att studera deras funktion. De transfekterade cellerna är lätt identifieras av epifluorescence mikroskopi efter samtidigt transfektion med cDNA för grönt fluorescerande protein (GFP). Vi jämför inspelningar av transfekterade celler till angränsande, untransfected nervceller i samma lager från samma skiva.
Vi har studerat uttrycket och funktionella roller spänningskänsliga kaliumkanaler i pyramidala neuron från råtta neocortex (4, 9-11). På grund av bristen på specifika farmakologiska medel för dessa kanaler, använder vi en genetisk metod för att manipulera kanal uttryck (1,14,15,17-19). Vi använder en organotypic kultur förberedelse (2,3, 5-8, 12,13,15-22). Ändras från den strategi Stoppini et al (16), i syfte att upprätthålla cellmorfologin och laminära mönster av cortex. Vi isolerar a…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Mayumi Sakuraba och Rebecca Foehring för enastående tekniskt bistånd. Dessutom vill vi tacka Dr. Rodrigo Andrade för att få hjälp med att genomföra organotypic slice kultur och biolistic protokoll transfektion och Dr Jeanne Nerbonne för att förse oss med cDNA konstruktioner för transfektion. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag: NS044163 från NINDS (för RCF).
Surgery / transfection / culture:
Media:
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording: