माउस meiotic कक्ष का फ्लो Cytometry शोधन
Summary
एक कुशल माउस वृषण से उच्च शुद्ध व्यवहार्य meiotic भिन्न प्राप्त वर्णित विधि है, जो फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ एक परिष्कृत सेल हदबंदी प्रोटोकॉल को जोड़ती है. इस विधि डीएनए सामग्री और परमाणु असतत meiotic भिन्न के घनत्व में अंतर का लाभ लेता है.
Abstract
वृषण में सेल प्रकार की विषम प्रकृति और meiotic सेल संस्कृति मॉडल के अभाव अद्वितीय भेदभाव प्रोग्राम है कि अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान प्रकट कर रहे हैं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं किया गया है. Elutriation या Staput (अवसादन) BSA और / या percoll gradients है का उपयोग: दो प्रमुख तरीके डिग्री बदलती करने के लिए शुद्ध, दोनों वयस्क और अपरिपक्व जानवरों से विभिन्न meiotic भिन्न विकसित किया गया है. इन तरीकों के दोनों सेल आकार और घनत्व meiotic कोशिकाओं 1-5 अलग पर भरोसा करते हैं. कुल मिलाकर, कुछ सेल 6 आबादी के लिए छोड़कर, इन प्रोटोकॉल के लिए कई meiotic सेल आबादियों कि विस्तृत आणविक विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं के लिए पर्याप्त शुद्धता उपज असफल. इसके अलावा, इस तरह के तरीकों के साथ आमतौर पर meiotic कोशिकाओं की एक प्रकार एक निश्चित समय है, जो reproducibility और समरूपता के बारे में जब meiotic सेल के नमूने की तुलना जटिलता के एक अतिरिक्त स्तर कहते हैं शुद्ध किया जा सकता है.
यहाँ, हम एक परिष्कृत विधि का वर्णन है कि एक आसानी से कल्पना करने के लिए की पहचान, और meiotic कोशिकाओं को शुद्ध की अनुमति देता, जर्म कोशिकाओं से गोल spermatids, Hoechst धुंधला 33,342 7,8 के साथ संयुक्त FACS का उपयोग कर. इस विधि पूरे meiotic की प्रक्रिया का एक समग्र स्नैपशॉट प्रदान करता है और एक अत्यधिक अर्धसूत्रीविभाजन के सबसे मंच से व्यवहार्य कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए अनुमति देता है. ये शुद्ध कोशिकाओं तो कि अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से प्रगति के साथ, उदाहरण के जीन अभिव्यक्ति 9,10 में परिवर्तन और nucleosome अधिभोग की गतिशीलता के लिए meiotic पुनर्संयोजन 11 के आकर्षण के केंद्र में आणविक परिवर्तन के लिए विस्तार में विश्लेषण किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
प्रोटोकॉल के साथ साथ प्रस्तुत एक साथ वयस्क नर चूहों से बहुत उच्च शुद्धता के साथ meiotic चरण कोशिकाओं की संपूर्ण रेंज शुद्ध जांचकर्ताओं इस मौलिक प्रक्रिया की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना के हिस्से में फ्लोरिडा के राज्य से स्क्रिप्स और पुरस्कार R01GM085079 और R21HD061304 जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बाल स्वास्थ्य और मानव विकास से, क्रमशः संख्या पैसा द्वारा समर्थित किया गया. यह स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट की पांडुलिपि संख्या 20917 है.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
Riferimenti
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