マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製
Summary
マウス精巣から高度に精製された実行可能な減数分裂分画を得るために効率的な方法は、蛍光活性化細胞選別（FACS）による洗練された細胞解離のプロトコルを組み合わせています、説明されています。このメソッドは、離散的な減数分裂画分のDNA含量の違いと核密度を利用しています。
Abstract
精巣の細胞型の異種性質と減数分裂細胞培養モデルの不在は、減数分裂時のマニフェストの一意の分化プログラムの研究に大きなハードルとなっている。 BSAおよび/またはパーコール勾配を使用して水簸またはStaput（沈降）：二つの主要なメソッドは、程度の差は、成人および幼若動物の両方から様々な減数分裂分画を精製するために開発されている。これらのメソッドの両方は1-5減数分裂細胞を分離するためにセルサイズと密度に依存しています。全体的に、少数の細胞集団6を除いて、これらのプロトコルは、詳細な分子解析のために必要な多数の減数分裂細胞集団の十分な純度を得るために失敗する。また、そのような方法で減数分裂細胞の通常一種類は、減数分裂細胞のサンプルを比較するときに再現性と均質性に関する複雑さの余分なレベルを追加する所定の時間、で精製することができる。
ここでは、ヘキスト33342染色7,8と組み合わせてFACSを用いて、生殖細胞から円形精子細胞に、1つは簡単に、視覚化、識別、および減数分裂細胞を浄化するための洗練された方法を説明します。このメソッドは、全体の減数分裂過程の全体のスナップショットを提供し、一つ非常に減数分裂の最もステージから生細胞を浄化することができます。これらの精製された細胞は、その後、遺伝子発現9,10と減数分裂組換え11のホットスポットでのヌクレオソームの占有率のダイナミクスの例の変更については、減数分裂を通しての進行に伴う分子の変化を詳細に分析することができます。
Protocol
Discussion
本明細書において提示されるプロトコルは、研究者がこの基本的なプロセスのダイナミクスを研究することができます、1つは同時に成体雄マウスから非常に高純度で減数分裂段階の細胞の範囲全体を浄化することができます。精製された細胞は、RNA抽出9,10、ヌクレオソームマッピング11、組換え分子の検出、タンパク質解析、および多くに至るまで多数のアプリケーション?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、フロリダ州のスクリップスと受賞の数字をそれぞれ一般医科学研究所と国立小児保健発育研究所からR01GM085079とR21HD061304、に金銭によって部分的にサポートされていました。これは、スクリップス研究所の論文番号20917です。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
Riferimenti
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