Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки
Summary
Эффективный метод получения высокоочищенного жизнеспособной мейоза фракций из семенников мышей описана, который сочетает в себе изысканный клеточной диссоциации протокол с люминесцентными активированный сортировки клеток (FACS). Этот метод использует различия в содержании ДНК и ядерной плотности дискретных мейоза фракций.
Abstract
Гетерогенный характер типов клеток в яичках и отсутствие мейоза модели культуры клеток были значительные препятствия для изучения уникальных программ дифференциации, которые проявляются во время мейоза. Два основных метода были разработаны для очистки, в разной степени, различных фракций мейоза от взрослых, так и незрелых животных: отмучивания или Staput (осаждение) с помощью BSA и / или Перколла градиентов. Оба эти методы основаны на размер ячейки и плотности отдельных мейоза клетки 1-5. В целом, за исключением нескольких клеточных популяций 6, эти протоколы не сможет привести к достаточной чистоты многочисленные мейоза клеточных популяций, которые необходимы для подробного молекулярного анализа. Кроме того, с такими методами как правило, один тип мейоза клетки могут быть очищены в данный момент времени, который добавляет дополнительный уровень сложности в отношении воспроизводимости и однородности при сравнении образцов мейоза клетки.
Здесь мы описываем точный метод, который позволяет легко визуализировать, идентифицировать, очистить и мейоза клетки, из половых клеток в круглых сперматид, используя FACS в сочетании с Hoechst 33342 окрашивание 7,8. Этот метод обеспечивает общий снимок всего процесса мейоза и позволяет очистить высоко жизнеспособных клеток от большинства стадии мейоза. Эти очищенные клетки могут затем быть детально проанализированы для молекулярных изменений, которые сопровождают прогрессии через мейоз, например, изменения в экспрессии генов, 9,10 и динамика нуклеосом размещение в горячих точках мейотических рекомбинации 11.
Protocol
Discussion
Протокол, представленные здесь, позволяет одновременно очистить от взрослых самцов мышей весь спектр мейоза клетки сцене с очень высокой чистоты, что позволяет исследователям для изучения динамики этого фундаментального процесса. Очищенные клетки могут быть использованы для многоч?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был поддержан частично денежные средства от штата Флорида в Scripps и наградить номера R01GM085079 и R21HD061304 из Национального Института общей медицинских наук и Национального института здоровья ребенка и развития человека, соответственно. Это рукописи номер 20917 из исследовательского института Скриппса.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
Riferimenti
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
