Konkurrenskraftiga Homing Analyser för att studien Gut-tropism T cell migration

Summary

Konkurrenskraftiga målsökande experiment gör det möjligt att direkt bedöma flyttande egenskaper av två olika cellpopulationer i en enda mus. Här har vi illustrerar detta förfarande genom att jämföra migration av ex vivo-genererade gut-tropism kontra icke-gut tropic celler T.

Abstract

För att utöva sin funktion lymfocyter behov av att lämna blod och migrera till olika vävnader i kroppen. Lymfocyter vidhäftning till endotelceller och vävnad extravasering är en flerstegsprocess som styrs av olika adhesionsmolekyler (målsökande receptorer) uttryckt på lymfocyter och deras respektive ligander (addressins) som visas på endotelceller ^{1 2.} Även om funktionen hos dessa vidhäftning receptorer delvis kan studeras ex vivo, det ultimata testet för deras fysiologiska betydelse är att bedöma deras roll under in vivo-lymfocyter vidhäftning och migration. Två kompletterande strategier har använts för detta ändamål: intravital mikroskopi (IVM) och homing experiment. Även IVM har varit nödvändigt att definiera den exakta bidrag från särskilda vidhäftning receptorer under vidhäftning kaskaden i realtid och i olika vävnader, är IVM tidskrävande och arbetsintensiv, det ofta kräver utveckling av avancerade kirurgiska tekniker, behöver den innan isolering av homogena cellpopulationer och den tillåter analys av endast en vävnad / organ vid varje given tidpunkt. Däremot konkurrenskraftiga målsökande experiment möjligt att direkt och samtidig jämförelse i migreringen av två (eller fler) cell delmängder i samma mus och även tillåter analys av många vävnader och av ett stort antal celler i samma experiment.

Här beskriver vi den klassiska konkurrenskraftiga målsökande protokoll som används för att bestämma fördel / nackdel för en viss celltyp till hem till specifika vävnader jämfört med en kontrollgrupp cellpopulation. Vi valde att illustrera flyttande egenskaper gut-tropism kontra icke gut-tropism T-celler, eftersom tarmslemhinnan är den största kroppsyta i kontakt med den yttre miljön och det är också den extra lymfvävnad med de bästa definierade flyttande krav . Dessutom har senaste arbete fastställt att vitamin A metabolit all-trans retinoinsyra (RA) är den viktigaste molekylära mekanism som ansvarar för att framkalla gut-specifik vidhäftning receptorer (integrin a4b7and kemokinreceptorn CCR9) på lymfocyter. Därmed kan vi skapa lätt ett stort antal tarm-tropism och icke tarm-tropism lymfocyter ex vivo genom att aktivera T-celler i närvaro eller frånvaro av RA, respektive, som slutligen kan användas i den konkurrensutsatta målsökande experiment som beskrivs här.

Protocol

1. Ex vivo-generationen tarm-homing och kontroll T-celler (se figur 1) Isolera splenocytes genom att mosa en mjälte från vildtyp möss. Resuspendera cellerna fjädring i PBS och centrifugera i 5 "vid 400 x g. Avlägsna supernatanten och lyseras de röda blodkropparna genom resuspending cellpelleten i 4 ml ACK lyseringsbuffert i 2-3 minuter. Efter det, tillsätt 5 ml PBS. Centrifugera i 5 "vid 400 xgi och avlägsna supernatanten. Resuspendera totalt splenocytes på 1 x 10 6<…

Discussion

Även om målsökande experiment ger mycket värdefull information om migration av totala cellpopulationer i en viss vävnad, bör man hålla i minnet att dessa analyser inte direkt analysera endotelceller vidhäftning och därför inte diskriminera på vilket steg (s) i flera steg vidhäftning kaskad (tethering / löpande, aktivering eller sticker) ett givet homing receptor agerar. Guldmyntfoten att definiera den särskilda roll som homing receptorer i vidhäftning Cascade är intravital mikroskopi (IVM) i vilka enskil…

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercaptoethanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO₃, 150 mM NH₄Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca⁺⁺ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin – IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).