झिल्ली प्रोटीन के गठनात्मक गतिशीलता की जांच बगल में साइट - निर्देश प्रतिदीप्ति लेबल के साथ

Summary

हम एक विधि है जो साइट विशिष्ट गठनात्मक परिवर्तन एकल कक्षों पर प्रतिदीप्ति का उपयोग का विश्लेषण के साथ – साथ झिल्ली प्रोटीन आयन परिवहन के कैनेटीक्स उपायों का वर्णन करेंगे. इस तकनीक आयन चैनल, ट्रांसपोर्टरों और आयन पंप के लिए अनुकूलनीय है और प्रोटीन सब यूनिटों के बीच की दूरी बाधाओं का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Abstract

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels², ion pumps³, and transporters⁴. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.

We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling^5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues^7,8. This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.

In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal⁵. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins⁴. Finally, recent developments have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein⁹.

Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (<5%)³ upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein¹⁰. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Protocol

1. प्रोटीन अभिव्यक्ति एक pTLN 11 या 12 pSG01MX जैसे Xenopus laevis oocyte अभिव्यक्ति के लिए उपयुक्त वेक्टर में ब्याज की झिल्ली प्रोटीन क्लोन. अनुकूलित वैक्टर दोनों 5 'और 3' Xenopus laevis β-ग्लोबिन untranslated 11,12 क्षेत्रों, एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट, और एक शाही सेना प्रमोटर साइट 5 'UTR से पहले 11 स्थित होते हैं. इन घटकों oocytes में इष्टतम अभिव्यक्ति, mRNA संश्लेषण और mRNA संश्लेषण से पहले प्लाज्मिड की linearization, क्रमशः के लिए आवश्यक हैं. 2. Cysteine ​​उत्परिवर्तन एक साजिश Kyte – Doolittle के लिए लक्षित प्रोटीन की transmembrane डोमेन की पहचान प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम का उपयोग (ProtScale, ExPASy) 13 के लिए कार्यरत है. डेटा hydrophobicity बनाम अनुक्रम संख्या के रूप में प्रदर्शित होता है. Residues कि सकारात्मक मूल्यों का प्रदर्शन सबसे अधिक संभावना transmembrane डोमेन में पाया जाता है. इस साजिश का उपयोग करने के लिए सबसे संभावित है कि सिस्टीन उत्परिवर्तित हो जाएगा transmembrane और बाह्य डोमेन के बीच इंटरफेस में स्थित अवशेषों का निर्धारण. Transmembrane डोमेन और बाह्य क्षेत्र के इंटरफेस का निर्धारण पूरा Kyte – Doolittle साजिश का उपयोग निश्चितता के साथ भविष्यवाणी नहीं कर सकते हैं के रूप में, यह अवशेषों जो इंटरफेस में होने की भविष्यवाणी कर रहे हैं की एक श्रृंखला की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटीन का यह क्षेत्र fluorophore.During एक गठनात्मक परिवर्तन की भविष्यवाणी आंदोलन के लिए चयनित है, की fluorophore एक हाइड्रोफिलिक और hydrophobic पर्यावरण के बीच या एक अधिक पानी शमन और कम पानी शमन वातावरण के बीच कदम होगा. वातावरण में इन भविष्यवाणी परिवर्तन के प्रत्येक प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन में परिणाम होगा. QuickChange साइट निर्देशित mutagenesis किट (Stratagene) extracellularly सुलभ सिस्टीन constructs उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. संक्षेप में, 10X प्रतिक्रिया बफर, 5 एनजी / μL प्लास्मिड डीएनए के 2 μL, 1.25 μL 100 / एनजी μL आगे की प्रत्येक और रिवर्स प्राइमर, dNTP (100 मिमी) के 1 μL, और डबल – आसुत के 39.5 μL 5 μL मिश्रण पानी. अन्त में, PfuTurbo डीएनए पोलीमरेज़ (Stratagene) के एक μL जोड़ें. इस कदम के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों ब्याज की एक कोशिकी अवशेषों में सिस्टीन उत्परिवर्तन के साथ डिजाइन किया जाना चाहिए. कार्यक्रम निम्नलिखित विनिर्देशों के लिए एक थर्मल cycler: 95 पर एक चक्र ° सी, 30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए 95 ° C पर 12-18 चक्र, 55 ° 1 मिनट और 68 के लिए सी डिग्री सेल्सियस केबी प्लाज्मिड लंबाई के प्रति एक मिनट के लिए. annealing तापमान (55 डिग्री सेल्सियस) प्रत्येक प्राइमर के पिघलने के तापमान से सीधे गणना की है. अंतिम चरण के लिए 4 तापमान पर पकड़ के लिए क्रमादेशित किया जा सकता डिग्री सेल्सियस अगर प्रतिक्रिया रातोंरात किया जाता है. चक्रों की संख्या उत्परिवर्तन पर निर्भर करता है. बिंदु उत्परिवर्तन, एक एकल एमिनो एसिड बदलने के लिए 16 चक्रों, या एकाधिक अमीनो एसिड सम्मिलन के लिए 18 चक्र के लिए 12 चक्र का प्रयोग करें. प्रतिक्रिया मिश्रण, pipetting द्वारा मिश्रण है, और 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (6000 rpm) DpnI (न्यू इंग्लैंड Biolabs) के एक μL जोड़ें. 37 पर 1 घंटे के लिए सेते ° C पानी के स्नान में. पिघलना बर्फ और सेते बाँझ समाज मीडिया (20 मिग्रा / मिलीलीटर tryptone, 5 मिलीग्राम / एमएल खमीर निकालने, 1 मिलीग्राम / एमएल NaCl, 0.4 मिलीग्राम / एमएल KCl, 0.02 एम 2 मिलीग्राम +, 0.02 पर शीर्ष 10 विद्युत सक्षम कोशिकाओं (Invitrogen) एम ग्लूकोज, ddH2O 37) डिग्री सेल्सियस जब तक आवश्यक है. विभाज्य 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में कोशिकाओं के 20 μL और कोशिकाओं को पचा डीएनए के एक μL जोड़ें. Porator सेल (जीवन टेक्नोलॉजीज) बर्फ के पानी के साथ भरें, 330 में समाई सेट μF, प्रभारी दर तेज करने के लिए, 4 kΩ के लिए वोल्ट बूस्टर और प्रतिरोध. पिपेट सेल porator cuvettes में समाधान / कोशिका के डीएनए के 20 μL. सेल Porator में cuvettes प्लेस, ढक्कन बंद, शक्ति कॉर्ड कनेक्ट करने के लिए, और सही क्युवेट करने के लिए डायल बारी. बिजली की आपूर्ति सेट प्रभारी और पकड़ '' जब तक वोल्टेज 430 पढ़ता है. डायल को हाथ और प्रेस को ट्रिगर करने के लिए मुड़ें. यदि वहाँ एक popping ध्वनि है, electroporation पुन: प्रयास करें. पिपेट क्युवेट से कोशिकाओं और उन्हें समाज मीडिया का 1.5 एमएल हस्तांतरण. 37 में 1.5 घंटे के लिए सेते ° झटकों के साथ सी. समाज / सेल / एम्पीसिलीन अगर प्लेट (10 मिलीग्राम / एमएल tryptone, 5 मिलीग्राम / एमएल खमीर निकालने, 10 मिलीग्राम / एमएल NaCl, 15 मिलीग्राम / एमएल अगर, DDH 2 हे और 100 एनजी / μL एम्पीसिलीन लेग के समाधान के 30 μL स्थानांतरण ). थाली पर कोशिकाओं फैलाओ और 37 पर थाली डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं. प्लेटों से हार्वेस्ट एकल कालोनियों और 5 एमएल लेग / एम्पीसिलीन (10 मिलीग्राम / एमएल tryptone, 5 मिलीग्राम / एमएल खमीर निकालने, 10 मिलीग्राम एमएल / NaCl, 100 एनजी / μL एम्पीसिलीन DDH 2 हे) मीडिया युक्त संस्कृतियों को टीका लगाना . 37 में हिलाओ ° 16-20 घंटे के लिए सी. एक डीएनए Nucleospin प्लाज्मिड किट (Macherey Nagel) का उपयोग miniprep प्रदर्शन. गुणात्मक agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा उत्पाद की जांच. Nanodrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग डीएनए की उपज Quantitiate. डीएनए अनुक्रमण द्वारा उत्परिवर्तन की प्रविष्टि सत्यापित करें. <p class="Jove_title"> 3. mRNA संश्लेषण 5 μL उपयुक्त बफर और 1 घंटे के लिए प्रतिबंध एंजाइम की एक μL 37.0 डिग्री सेल्सियस के साथ 50 एल प्रतिक्रिया मात्रा में डीएनए, पचाने में प्लास्मिड डीएनए के तीन μg linearize उच्च शुद्ध पीसीआर उत्पाद शोधन किट (Roche एप्लाइड साइंस) का उपयोग करना, पचाने में शीशी और भंवर संक्षिप्त 350 μL बाध्यकारी बफर जोड़ें. इस किट के रूप में यह जो उत्पाद शाही सेना ग्रेड बनाता guanidiniumisothiocyanate शामिल किया जाता है. संग्रह ट्यूबों में स्पिन स्तंभों प्लेस और पचाने में डीएनए समाधान के साथ स्तंभ लोड. 20 सेकंड के लिए +१८००० जी अपकेंद्रित्र और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. स्तंभ धोने बफर के 500 μL जोड़ें. अपकेंद्रित्र १८,००० छ पर 20 सेकंड और के माध्यम से प्रवाह त्यागें. स्तंभ धोने बफर के 200 μL जोड़ें. 30 सेकंड अपकेंद्रित्र या जब तक स्तंभ 18,000 पर सूखी है जी प्लेस एक autoclaved 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्पिन स्तंभ और स्तंभ DEPC पानी का इलाज के 50 μL जोड़ने. १८,००० पर 30 सेकंड के लिए जी centrifuging द्वारा Elute लगभग 15 μL समाधान के 3 μL में 0.5 μg में जो परिणाम eluted डीएनए ध्यान लगाओ. प्लाज्मिड डीएनए (SP6, T7) में प्रमोटर साइट अनुक्रम के अनुसार सही mMessage mMachine किट (Ambion) चुनें. 5 μL एक मिश्रण एनटीपी टोपी, 3 μL पिछले कदम से linearized डीएनए, 1 μL प्रतिलेखन बफर, और उपयुक्त आरएनए पोलीमरेज़ 1 μL जोड़ें. 37 में 1.5-2 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस वर्षा के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए किट से 12.5 LiCl की μL, 15 μL DEPC पानी, मिश्रण संक्षिप्त (भंवर नहीं है), जी ११००० में 10 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र, और -20 ° सी दुकान में जोड़ें. 4 करने के लिए पूर्व शांत अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और पूरी गति से तेज़ी के बाद कम से कम 15 मिनट अपकेंद्रित्र. Centrifugation के बाद एक भूरे रंग गोली ट्यूब के तल पर दिखाई जानी चाहिए. ध्यान से और पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला हटाने और -20 डिग्री सेल्सियस के लिए 70% आरएनए ग्रेड इथेनॉल के 150 μL ठंडा जोड़ने पूरी रफ्तार से 5 मिनट के लिए 4 ° C में अपकेंद्रित्र. एक Eppendorf Vacufuge प्लस में पूरी तरह से संक्षिप्त शुष्क सतह पर तैरनेवाला (1-2 मिनट) निकालें, और DEPC पानी की 12 μL में अब सफेद गोली भंग. Nanodrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (थर्मो वैज्ञानिक) का उपयोग mRNA की उपज Quantitiate. 4. Oocyte हटाना इस प्रोटोकॉल डब्ल्यूपीआई संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. पहले आपरेशन करने के लिए, मेंढक 12 घंटे के लिए उपवास किया जाना चाहिए करने के लिए सर्जरी के दौरान उल्टी रोकने के. 0.5-3.0 छ MS-222 के समाधान के पानी में भंग. सोडियम बिकारबोनिट जोड़ें जब तक समाधान एक 7.0-8.0 पीएच है. MS-222 मेंढक के लिए एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि के रूप में सर्जरी के दौरान प्रयोग किया जाता है. यह महत्वपूर्ण है हर समय nitrile दस्ताने पहनते हैं, जबकि MS-222 हैंडलिंग और एक रासायनिक हुड के तहत समाधान तैयार समाधान एमएस 222 में मेंढक विसर्जित जब तक मेंढक को ठीक करने और पैर के अंगूठे चुटकी सजगता खो दिया है. Unresponsiveness की जांच करने के लिए, मेंढक के पैर के अंगूठे चुटकी. पृष्ठीय पक्ष पर एक गीला डायपर पैड के शोषक तरफ मेंढक रखें. इस मेंढक की त्वचा को नुकसान से बचा जाता है. एक गीला कागज तौलिया सभी समय मेंढक के लिए बंद रखें, के रूप में मेंढक सर्जरी भर नम रखा जाना चाहिए. यदि मेंढक की आँखें खुली हैं, यह महत्वपूर्ण है उन्हें नमकीन घोल के साथ गीला है. यदि मेंढक जागरण के लक्षण दिखाता है, मेंढक पर संवेदनाहारी समाधान डालना और इंतजार जब तक मेंढक अनुत्तरदायी हो जाता है. प्रक्रिया जारी रखने से पहले एक दूसरे पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन. एक छोटे से या तो छोड़ दिया या मेंढक midline की सही coelomic चीरा बनाओ. चीरों के बाद सर्जरी के साथ पक्षों बारी पर बनाया जाना चाहिए. मेंढक की बाहरी अंडाशय ले आओ और अंडाशय हटायें. मेंढक त्वचा के अंडाशय को छूने से बचें. यदि रक्त स्राव होता है, एक बाँझ क्यू की नोक के साथ दबाव लागू जब तक खून बह रहा बंद हो जाता है. सीवन चीरा 3.0-4.0 Ethicon Vicryl सिवनी सामग्री (जॉनसन एंड जॉनसन) के साथ एक बाधित सीवन पैटर्न का उपयोग. जब suturing, शल्य चिकित्सा उपकरणों का उपयोग करने के लिए एक समय में एक गाँठ बाँध और मेंढक की त्वचा को छू से बचने के. Coelomic और त्वचा परतों अलग सीवन यह भी महत्वपूर्ण है. यह अंडे और Xenopus laevis में oocyte कटाई के लिए NIH दिशानिर्देश (देखें: के साथ संगत है http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). सर्जरी के बाद, मेंढक ऑपरेशन कम से कम 2 महीने के लिए नहीं करानी होगी. यह भी अगर मेंढक काफी स्वस्थ बाद सर्जरी से गुजरना है निर्धारित किया जाना चाहिए. 6 सर्जरी के एक अधिकतम 6 वें सर्जरी किया जा रहा है टर्मिनल के साथ प्रत्येक मेंढक पर प्रदर्शन किया जा सकता है है. 5. Oocyte Defoculation और mRNA इंजेक्शन पृथक डिम्बग्रंथि पालि के छोटे भागों में कैंची के साथ विभाजित है. clumps घंटी समाधान + collagenase के साथ + 2 Ca (8.6 में स्थानांतरित कर रहे हैंछ / एल NaCl, 0.3 छ / एल KCl, और 0.33 ग्राम / एल 2 CaCl). धीरे से 2 बजे के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर पचाने में समाधान हिला Ca 2 + (8.6 छ / एल NaCl और 0.3 छ / एल KCl) – अगर सबसे oocytes अलग हो रहे हैं, घंटी समाधान के साथ oocytes धोने . घंटी समाधान में दस मिनट के लिए oocytes सेते – Ca 2 +. घंटी का समाधान + Ca + 2 oocytes स्थानांतरण . MRNA की 25 एनजी के साथ सुई oocytes, Nanoject द्वितीय ऑटो nanoliter इंजेक्टर (Drummond) के साथ एक 50 NL के अंतिम मात्रा में, 3.5 "Drummond केशिका ट्यूब नोट के साथ: mRNA की राशि लक्ष्य प्रोटीन के अनुसार बदलता रहता है. इंजेक्शन, सेते oocytes के बाद घंटी समाधान में 3-7 दिनों (90 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 5 मिमी MOPS, 2 मिमी 2 CaCl, 7.4 पीएच) और 1 मिलीग्राम / एमएल gentamycin 18 ° अंधेरे 8 में सी . 6. साइट – विशिष्ट प्रतिदीप्ति लेबलिंग माप के लिए पहले, लदान बफर में 45 मिनट (110 मिमी NaCl, 2.5 मिमी सोडियम साइट्रेट, और 10 मिमी MOPS / 7.4 पीएच पर Tris) और बाद लोडिंग बफर में 45 मिनट (100 मिमी NaCl, 1 मिमी 2 CaCl के लिए oocytes सेते हैं , 5 मिमी 2 BaCl, 5 मिमी 2 NiCl, और 10 मिमी / 7.4 पीएच) पर MOPS Tris intracellular ना + 14 एकाग्रता बढ़ाने के लिए. प्रतिदीप्ति माप के लिए, एक बफर के बाद लोड हो रहा है कि वांछित fluorophore पूर्व [5 सुक्ष्ममापी शामिल सेते oocytes. (TMRM) tetramethylrhodamine 6 maleimide या fluorescein-5-maleimide (एफएम) 5-10 मिनट के लिए]. Fluorophore लेबलिंग के बाद, oocytes exhaustively धोने डाई मुक्त लोडिंग के बाद 3 बफर के साथ. 7. इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी Borosilicate (1B150F 4, विश्व प्रेसिजन उपकरण) capillaries के एक micropipette डांड़ी (पीसी 10 मॉडल, Narishige) का उपयोग कर खींच द्वारा microelectrodes करें. एम 3 KCl के साथ इलेक्ट्रोड भरें और प्रतिरोध परीक्षण. प्रतिरोध 0.5-1.5 15 MΩ के बीच होना चाहिए . एक 535DF50 उत्तेजना फिल्टर, एक 565 EFLP उत्सर्जन फिल्टर, और सिस्टीन स्कैनिंग प्रयोगों के लिए एक 570DRLP dichroic दर्पण (ओमेगा ऑप्टिकल) के साथ प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (कार्ल Zeiss, Axio परीक्षक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप) से लैस. प्रतिदीप्ति खुर्दबीन मंच पर एक आर.सी. 10 कक्ष (वार्नर उपकरण) में oocyte प्लेस और धीरे oocyte में गढ़े इलेक्ट्रोड डालने. टर्बो प्रवर्धक Tec-05X (NPI इलेक्ट्रॉनिक्स) का उपयोग करना, एक निरंतर मूल्य पर झिल्ली संभावित पकड़ और झिल्ली निम्नलिखित समाधान विनिमय भर या झिल्ली संभावित बदलकर आयन प्रवाह को मापने. समवर्ती प्रतिदीप्ति माप के लिए, एक 100 डब्ल्यू टंगस्टन प्रकाश स्रोत का उपयोग करने के लिए दाता fluorophore और एक पिन 022A photodiode (संयुक्त वेक्षक टेक्नोलॉजीज) प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उत्तेजित. दोनों एम्पलीफायर और photodiode एक Digidata 1440A डाटा अधिग्रहण (Axon उपकरण) एक pCLAMP10 डाटा अधिग्रहण और रिकॉर्डिंग के लिए सॉफ्टवेयर (Axon उपकरण) का उपयोग कंप्यूटर के साथ प्रणाली, के माध्यम से interfaced हैं. सिस्टीन स्कैनिंग के लिए, स्थिर वर्तमान का उपयोग वोल्टेज कदम है कि pCLAMP 10 सॉफ्टवेयर (आण्विक उपकरण) के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं पर प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन को मापने के. ब्याज की झिल्ली प्रोटीन पर निर्भर करता है, कोशिकी समाधान के लिए स्थिर वर्तमान को सुनिश्चित करने के लिए बनाया गया है. प्रतिदीप्ति तीव्रता में लक्षित प्रोटीन की कार्यात्मक माप में परिवर्तन सहसंबंधी. 8. Anisotropy माप और दूरी प्रतिबन्ध का निर्धारण. Κ 2 मूल्यों की सीमा की गणना Anisotropy माप दूरी 8 माप बगल में लिया जाना चाहिए . Anisotropy 16 रोटेशन के कारण की fluorophore सापेक्ष गतिशीलता उपाय. Polarized फिल्टर (Linos फोटोनिक्स, Inc) का उपयोग करना, समानांतर और सीधा एफएम या TMRM अमीनो एसिड के अवशेष पर ब्याज की polarized प्रकाश के साथ निम्नलिखित उत्तेजना द्वारा उत्सर्जित प्रकाश के उपाय. माप समाधान विनिमय 8 शर्तों और लगातार झिल्ली को fluorophores की गतिशीलता को निर्धारित करने की क्षमता के तहत लिया जाता है. Anisotropy r द्वारा दिया जाता है = (मैं | | मैं – ⊥) / (मैं | | + 2I ⊥) जहाँ मैं | | समानांतर प्रकाश उत्सर्जित होता है और मैं ⊥ सीधा प्रकाश 16 उत्सर्जित होता है. दूरी माप में त्रुटि की गणना करने के लिए, κ 2 अधिकतम = 2 / 3 (1 + F तीसरी + एफ आर ए + 3F तीसरी * एफ आर ए) और κ 2 मिनट = 2 / 3 (1 – 2 (F तीसरी + आर ए एफ) / ) जहां तीसरी एफ = (r / घ आर ओ 0.5) और एफ आर ए = (नि. एक r / ओ) 0.5, आर TMRM, आर एंड डी के anisotropy एफएम के anisotropy है, और आर ओ प्रत्येक 8 की fluorophore मौलिक anisotropy . दूरी बाधाओं को मापने के लिए, एक holoenzyme है जो दो सुलभ कोशिकी सिस्टीन resid है का उपयोग करेंues. के रूप में oocytes एक निरंतर झिल्ली क्षमता और माप के दौरान इसलिए निरंतर दूरी पर आयोजित किया जाएगा, वहाँ प्रोटीन के गठनात्मक राज्य के एक समारोह के रूप में एक प्रतिदीप्ति परिवर्तन होने की जरूरत नहीं है. पोस्ट लोड हो रहा है 1 सुक्ष्ममापी एफएम (स्वीकर्ता fluorophore) और 4 (दाता fluorophore) अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट के लिए सुक्ष्ममापी TMRM, या केवल एक एफएम सुक्ष्ममापी युक्त बफर में oocytes सेते हैं. इस के साथ और एक स्वीकर्ता के बिना 8 fluorophore लेबल holoenzymes के लिए बनाया जा माप के लिए अनुमति देता है. 475DF40 उत्तेजना फिल्टर, 530DF30 उत्सर्जन फिल्टर, और 505DRLP dichroic दर्पण के साथ खुर्दबीन लैस. दाता और स्वीकर्ता की fluorophore उपस्थिति अनुपस्थिति में विरंजन के समय निर्भरता उपाय. इन मापों के समय के दौरान, समाधान प्रवाह निरंतर होना चाहिए. अन्यथा, एक समय पर प्रतिदीप्ति वृद्धि प्रेरित गर्मी मनाया जा सकता है. के साथ और बिना स्वीकर्ता fluorophore photodestruction में अंतर दो अवशेषों के बीच की दूरी की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Holoenzymes केवल दाता fluorophore युक्त एक स्वीकर्ता fluorophore के साथ holoenzymes की तुलना में एक तेज photodestruction दर का अनुभव करेंगे. दोनों एक दाता और स्वीकर्ता fluorophore युक्त Holoyenzymes धीमी photodestruction जब करीब निकटता में एक दूसरे 8 दरों प्रदर्शन करेंगे. PClamp10 में Clampex सुविधा का प्रयोग, औसत चार oocyte रिकॉर्डिंग की एक न्यूनतम के लिए दाता की fluorophore photodestruction के परिणाम. एक बार परिणाम औसतन किया गया है, एक घातीय समारोह (monoexponential biexponential) का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा फिट का एक वक्र प्राप्त है. सबसे अच्छा फिट की वक्र दाता की fluorophore साथ photodestruction के लिए और स्वीकर्ता बिना समय निरंतर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता समीकरण द्वारा दिए गए ई = 1-Γ डीए / Γ 17 डी, जहां GDA fluorophore / दाता स्वीकर्ता जोड़ी और Γ विकास केवल दाता fluorophore के लिए लगातार समय के लिए संदर्भित करता है के लिए लगातार समय के लिए संदर्भित करता है. निर्धारित Equation17 Forster का उपयोग, ई = 1 / (1 ​​+ 6 आर आर / ओ 6), लेबल सिस्टीन अवशेषों के बीच की दूरी निर्धारित किया जा सकता है, ई है दक्षता झल्लाहट, आर दाता और स्वीकर्ता fluorophore के बीच की दूरी है, और आर ओ है 50% 17 बाँधना दाता और स्वीकर्ता के लिए दक्षता की दूरी . आर ओ समीकरण द्वारा शासित है आर ओ = (3 9.7×10 JΦ डी पता -4 κ 2) जम्मू दाता उत्सर्जन और अवशोषण स्वीकर्ता की सामान्यीकृत वर्णक्रमीय ओवरलैप कहाँ है, Φ डी एक स्वीकर्ता fluorophore बिना दाता के उत्सर्जन की मात्रा उपज है , n अपवर्तन के सूचकांक है, और 2 κ द्विध्रुवीय – द्विध्रुवीय 8 बातचीत के लिए अभिविन्यास कारक है. 9. प्रोटीन सब यूनिटों के सापेक्ष आंदोलन डबल सिस्टीन constructs जो स्वीकर्ता और दाता fluorophores के साथ लेबल रहे हैं का उपयोग करें. इन प्रयोगों के लिए दो सिस्टीन अवशेषों के बीच की दूरी में परिवर्तन मापा जाएगा. चूंकि यह मामला है, प्रत्येक अवशेषों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता निम्नलिखित लेबलिंग 8 प्रोटीन के गठनात्मक राज्य के स्वतंत्र होना चाहिए. इस प्रकार, प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण में कोई परिवर्तन दाता और स्वीकर्ता fluorophores के बीच की दूरी के एक परिवर्तन का परिणाम हो जाएगा. एक उत्तेजना 475AF40 फिल्टर उत्सर्जन 595AF60, फिल्टर और 505DRLP dichroic दर्पण के साथ खुर्दबीन से लैस. इन प्रयोगों के लिए, दाता और उत्साहित है और स्वीकर्ता fluorophore के प्रतिदीप्ति मापा जाता है. झिल्ली प्रोटीन को सक्रिय करने के लिए और साथ ही प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन को मापने के उपयुक्त विधि (वोल्टेज, ligand, समाधान मुद्रा) का प्रयोग करें. प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि का संकेत होगा कि दो fluorophores और इस प्रकार दो अवशेषों करीब एक साथ आगे बढ़ रहे हैं. प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी का संकेत मिलता है कि दो fluorophores और इस प्रकार दो अवशेषों आगे बढ़ रहे हैं के अलावा. अंत में, प्रतिदीप्ति तीव्रता में कोई परिवर्तन नहीं संकेत जाएगा कि दो fluorophores और इस तरह दो अवशेषों प्रोटीन की रचना में परिवर्तन पर एक ही दूरी पर हैं. 10. प्रतिनिधि परिणाम विशिष्ट fluorophores साथ कोशिकी सिस्टीन अवशेषों लेबल झिल्ली प्रोटीन के गठनात्मक परिवर्तन पर आंदोलन की जांच के लिए सक्षम बनाता है. एक ठेठ वोल्टेज क्लैंप fluorometry ट्रेस चित्र 1 में दिखाया गया है. प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन (कम ट्रेस) है, जो एक और अधिक और अधिक hydrophobic पर्यावरण के लिए हाइड्रोफिलिक है या एक अधिक पानी शमन से कम पानी शमन पर्यावरण के लिए आंदोलन की fluorophore समाधान मुद्रा पर प्रोटीन में एक गठनात्मक परिवर्तन (ऊपरी परिणाम ट्रेस). इस तकनीक Exten किया जा सकता हैदो अवशेषों के बीच दूरी का निर्धारण करने के लिए ded. इस तरह की प्रयोगात्मक परिणाम चित्रा 2 में दिखाया जाता है. एक स्वीकर्ता flurophore (लाल) की उपस्थिति में, photobleaching एक स्वीकर्ता fluorophore (काला) के बिना तुलना में एक धीमी दर पर होता है. photobleaching की दर सीधे Forster 17 समीकरण के अनुसार दो fluorophores के बीच की दूरी से संबंधित है. इस तरह के परिणाम प्रोटीन के विभिन्न गठनात्मक राज्यों को सहसंबद्ध किया जा सकता है के रूप में दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज क्लैंप अग्रानुक्रम में प्रदर्शन प्रयोगों द्वारा सत्यापित है. चित्रा 1 आयन परिवहन और प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग. शीर्ष ना + परीक्षण समाधान और कश्मीर + 10 सुक्ष्ममापी और 10 मिमी ouabain की उपस्थिति में परीक्षण समाधान की उपस्थिति में वर्तमान दबाना माप. नीचे, वर्तमान दबाना 3,8,19 माप के साथ अग्रानुक्रम में मापा पुष्पन तीव्रता में परिवर्तन. चित्रा 2. समय की निर्भरता photobleaching. दाता photodestruction अनुपस्थिति (काला) और स्वीकर्ता fluorophore (लाल) की उपस्थिति में मापा जाता है. प्रत्येक ट्रेस 4 oocyte रिकॉर्डिंग के औसत है.

Discussion

प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है कि हम का वर्णन साइट विशेष fluorophore लेबलिंग और दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज और झिल्ली प्रोटीन की संरचना और समारोह के बीच संबंधों की जांच करने के लिए क्लैंप को जोड़ती है. इस तकनीक झिल्ली प्रोटीन के गठनात्मक गतिशीलता पर आयन परिवहन के दौरान समय – हल जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस दृष्टिकोण आयन पंप, आयन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के रूप में विभिन्न प्रोटीन के साथ काम करने के लिए अनुरूप किया जा सकता है.

एक विशिष्ट अवशेषों पर गठनात्मक गतिशीलता की जांच करने के लिए इसके अलावा, यह भी संभव है प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण का उपयोग करने के लिए एक holoenzyme भीतर दूरी बाधाओं को निर्धारित है. अवशेष के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सब यूनिटों के बीच रिश्तेदार आंदोलन को मापने के बीच दूरी का निर्धारण में मदद कुंजी gating तंत्र से जुड़े सवालों को हल कर सकते हैं.

Materials

Reagent/Equipment	Company	Reagent/Equipment	Company
100W Tungsten Light Source	Carl Zeiss Microimaging	fluorescein-5-maleimide	Invitrogen
1B150F-4	World Precision Instruments	High-Pure PCR Extraction Kit	Roche
3.0-4.0 Ethicon Vicryl	Johnson & Johnson	mMessage mMachine Kit	Ambion
475AF40 excitation filter	Omega Optical	MS-222	Sigma-Aldrich
505DRLP dichroic mirror	Omega Optical	Nucleospin Plasmid Kit	Macherey-Nagel
Macherey-Nagel	Omega Optical	Nanodrop 2000c Sprectrophotometer	Thermo Scientific
535DF50 excitation filter	Omega Optical	PC-10 Micropipette Puller	Narishige
560DRLP dichroic mirror	Omega Optical	pCLAMP 10 Software	Axon Instruments
565ALP emission filter	Omega Optical	PfuTurbo DNA Polymerase	Strategene
565EFLP emission filter	Omega Optical	PIN-022A Photodiode	United Detector Technologies
570DRLP dichroic mirror	Omega Optical	Polarized Filters	Linos Phtonics Inc.
Linos Phtonics Inc.	Omega Optical	QuickChange Site-Directed Mutagenisis Kit	Stratagene
Axio Examiner Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging GMBH	RC-10 Fluorescence Chamber	Warner Instruments
Warner Instruments	Life Technologies	tetramethylrhodamine-6-maleimide	Invitrogen
Digidata 1440A data acquisition system	Axon Instruments	TOP10 Electrocompetent Cells	Invitrogen
Dpn I	New England Biolabs	Turbo Tec-05X amplifier	npi