هنا نبين كيفية استخدام القرب ربط الفحص (PLA) ، مع مجموعة من الأجسام المضادة لبروتين العظام تصور التخلق (BMP) يشير في خلايا محددة. سمحت لنا هذه التقنية لمتابعة تراكم النووية الذاتية BMP – المستجيب تنشيط المجمعات وتحديد مستوياتها على مر الزمن تحت BMP4 التحفيز.
أفضل الممارسات الإدارية هي المسؤولة عن طائفة واسعة من الآثار التنموية والبيولوجية. تنشيط مستقبلات BMP (phosphorylate) والمستجيبات Smad1/5/8 ، التي بعد ذلك ، شكل مجمع ونقل من مكان لآخر مع Smad4 إلى النواة حيث تعمل بوصفها عوامل النسخ لبدء الآثار BMP المصب محددة 1. المناعية التقليدية مضان التقنيات مع أجسام مضادة ضد الفوسفات وصماد الببتيدات يحمل حساسية منخفضة ، وتقديم خلفية عالية الكمي الإجمالي لأنها تعتمد على كثافة إشارة الضد لا سيما إذا كان هذا هو حساس الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، قد الفوسفات وSmads لا تكون كلها في مجمع مع Smad4 وشارك في النسخ النشطة.
جيش التحرير الشعبى الصينى في الموقع هي تكنولوجيا قادرة على اكتشاف بروتين تفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية 2-4. هذه الأجسام المضادة الجديدة الأزواج الاعتراف التكنولوجيا مع التضخيم من الحمض النووي بديل للبروتين. فإنه يولد المترجمة ، إشارة منفصلة على شكل بقع الكشف عن الموضع الدقيق للحدث الاعتراف. ويمكن الاعتماد على عدد من الإشارات ومقارنتها توفير القياس. طبقنا في جيش التحرير الشعبى الصينى الموضع ، وذلك باستخدام عدة Duolink ، مع مجموعة من الأجسام المضادة التي تتيح الكشف عن المستجيبات يشير BMP phospho-Smad1/5/8 وSmad4 فقط عند هؤلاء في أي القرب في مجمع ، والذي يحدث فقط مع إشارات التنشيط. هذا يسمح للمرة الأولى ، تصور وقياس BMP الذاتية يشير مع خصوصية عالية وحساسية في زمن التجربة بالطبع تحت BMP4 التحفيز.
التصور المجمعات البروتين في الموقع هي في الطلب الكبير ، ولا سيما بالنسبة للدراسات في إشارة حيث التفاعل وتعديل البروتين البروتين هي الوسائل التي تستعملها الخلايا لارسال اشارة من سطحها إلى النواة. لم يكن من الممكن تصور وتحديد المجمعات بين اثنين من البروتينات الذاتية في الموقع مع المناعي من قبل. شارك في معارض توطين الأضداد القرار المنخفضة والتي لا يمكن استخدامها لتصور تفاعل حقيقي. جيش التحرير الشعبى الصينى هو الاسلوب الجديد الذي بدأت به الباحثون في نظم مختلفة مع النجاح الكبير 6 ، 7. هنا ، ونحن لشرح كيفية استخدام جيش التحرير الشعبي الصيني ، ليس فقط لتصور ولكن أيضا لتحديد المجمعات المحلية بين المستجيبات صماد تنشيط المصب من التحفيز BMP مع مرور الوقت. استخدمنا خلايا الأنسجة المختلفة بما في ذلك Neuro2a وتعتمد على الأجسام المضادة التي أثيرت في الأنواع التجارية المختلفة (الماوس ، والأرانب Smad4 aP-Smad1/5/8) لتحقيق هذا (الشكل 1). هذا الأسلوب يسمح لنا ، لأول مرة ، لمعرفة تفعيل المجمعات المستجيب – BMP مع مرور الوقت وليس فقط وجود Smad1/5/8 فسفرته ، والتي قد لا تكون في جميع المجمعات نشطة مع Smad4. أحصينا الاشارات (التين 1F) ومقارنة مع قياس الكمي التي تم الحصول عليها من طخة مناعية من نفس الخلايا 8 (الشكل 1G). استنتجنا أن عدد البقع توفر دقة القياس المقارن للإشارات المستويات مع مرور الوقت. كما تم تطبيق هذه التقنية على خطوط الخلايا الأخرى (HEK293T وCos7) مع نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات).
ويستند مبدأ التكنولوجيا على تحقيقين فريدة من نوعها تقدم مع عدة Duolink. كل مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى يتكون من الأجسام المضادة الثانوية الملحقة قليل النوكليوتيد الاصطناعية فريدة من نوعها ، التي تعمل كمراسلة. على مقربة من التحقيقات يسمح ربط الحمض النووي في المكان المحدد حيث تعلق هذه التحقيقات في القرب. المسافة من [أليغنوكليوتيد] ، والذي يسمح التهجين الحمض النووي وربط صغيرة (<40nm) ، وبالتالي ، لا يمكن إلا أن تتفاعل البروتينات تتيح ربط. ويمكن بعد ذلك أن الحمض النووي ligated تضخيمها والكشف عن تهجين مع المسمى [أليغنوكليوتيد] تسلسل تضخيمها. والتضخيم غير محددة لأنها تعتمد على مبادئ تهجين الحمض النووي DNA ، ويوفر أيضا حساسية عالية كما هو تضخيم الحمض النووي ligated عدة أضعاف مما أدى إلى تعزيز ربط الحدث الأولي. يتم الكشف عن الحمض النووي التي تضخمت التهجين مع [أليغنوكليوتيد] وصفت وتنتج بقعة واضحة وكبيرة نوعا ما. كما يمكن أن تحسب النقاط ، إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر ليس فقط على المعلومات المكانية الدقيقة (موقع أحداث التفاعل) ، ولكن أيضا وسيلة قياس الهدف من هذه الأحداث 2-4.
غيرها من التقنيات التي تستخدم للكشف عن البروتين التفاعلات منها العيش المشترك ، مناعي ، immunofluoresence ونيون نقل الطاقة الرنين (الحنق). وتستخدم على نطاق واسع شارك في مناعي المقايسات تمكين عزل بروتين المجمعات. ويرافق الطريقة التي immunoblotting مما يعني أنه يجب أن يتم التعبير عن البروتينات عند مستويات مرتفعة نسبيا ليتم الكشف. مشاكل خلفية عالية أو غير محددة وملزمة لبعض البروتينات لحبات في بعض الأحيان من الصعب التغلب عليها في مناعي المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، شارك في مناعي المقايسات السماح للكشف عن البروتينات التي يمكن أن تكون جزءا من بروتين معقد ولكن لا يمكن التمييز بين تلك التي هي على مقربة جدا جسديا التفاعل مع بعضها البعض. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تشارك في immunoprecipitations لا توفر الكميات في قرار خلية واحدة أو معلومات عن توطين المجمعات البروتين في الخلية. ويستند الكشف التعايش مجمعات البروتين في الخلية أو حجرة خلية immunofluoresence على التداخل في إشارات تنتشر وبالتالي ، فإن القرار المكانية منخفضة ، ولا يمكن توفير معلومات دقيقة عن التفاعلات البروتينية. ويمكن أن يتم التحديد الكمي للإشارة immunofluoresence البصرية عن طريق تقدير إلا إذا كان الفرق هو أضعاف عدة ، ويمكن أن لا تكون دقيقة أو قابلة للقياس مثل البقع جيش التحرير الشعبى الصينى. الحنق يسمح التصور من المجمعات البروتين في الخلايا الحية ويتغلب على الحاجة إلى الأضداد ، وتعرض للحاتمة. لكن الحنق يعتمد عادة على overexpression من البروتينات تنصهر الاصطناعية ، والتي قد لا تعكس مجمعات البروتين الذاتية كما في جيش التحرير الشعبى الصينى.
شروط حظر في بروتوكول جيش التحرير الشعبى الصينى حاسمة بأنها تجميع الأجسام المضادة وزيادة قد تحدث في الخلفية. ويمكن الاطلاع على شروط بديلة تسد في ورقة المنتج الأضداد. ضوابط ملائمة مع إغفال الضد الابتدائية والثانوية تقديم معلومات بشأن ما قد حصل من خطأ وأنها بحاجة إلى أن تدرج دائما. من المهم أن الشاشة الأضداد المختلفة التي من شأنها أن تعطي خلفية الأقل عندما تستخدم وحدها ، وأفضل إشارة عندما يكونان معا. التثبيت من سلأمر بالغ الأهمية ليرة سورية مع الافراط في تحديد المجمعات قد يسبب البروتين لتفسد تماما وتتحلل ، في حين أن التثبيت غير كاف قد يؤدي إلى فقدان البروتين المجمعات خلال خطوات الإجراء. يمكن التحكم بذلك عن طريق تخفيض تركيز تثبيتي إلى 3 ٪ أو عن طريق الحد من الوقت التثبيت. ومع ذلك ، فإن تثبيت يعتمد أيضا على ما إذا كانت الأجسام المضادة الأولية الاعتراف البروتينات المعطل أم لا. وهذا الاسلوب هو جيش التحرير الشعبى الصينى حساسة للغاية ، وهناك حاجة إلى رعاية خاصة للحفاظ على حضانة الأوقات والظروف الدقيقة المساواة بين عينات مختلفة.
لا ينبغي أن تكون العينات تترك لتجف في أي حال قبل الخطوة النهائية. يمكن تجفيف العينات يؤدي إلى زيادة الخلفية. الإزالة الكاملة للعرقلة الحل أمر بالغ الأهمية أيضا من أجل تجنب الخلفية. يجب دائما غسل المخازن أن يقدموا إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام ، ودرجة حرارة منخفضة يبطئ التفاعلات الأنزيمية. لاستكشاف مزيد من الرجوع إلى دليل لكيت.
ومن المفيد استخدام بقع للتأكد من الترجمة شبه الخلوية للإشارة جيش التحرير الشعبى الصينى (مثل دابي ، أكتين الخ). هنا استخدمنا دابي (في المتوسط التركيب) لصمة النوى. جيش التحرير الشعبى الصينى متوافق مع استخدام المناعي مع أجسام مضادة لتحديد نوع الخلية أو مقصورة الخلوية (لا يظهر هنا). ويمكن أن يتم تقدير دقيق عن طريق عد الإشارات ، واستخدام برامج معينة (Duolink أداة الصور ، Olink Biosience).
في الختام لقد أثبتنا في كيفية استخدام الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وذلك باستخدام عدة للكشف عن Duolink BMP يشير في الخلايا الثابتة وقدم مزاياه : سهل الاستخدام ، وحساسة للغاية ، الخلفية لا ، وقدرة فريدة لتحديد BMP نشط يشير في الموقع.
الحد من تطبيق هذه التقنية لدراسة التفاعلات بين البروتينات المختلفة يعتمد على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة الأولية التي تعترف البروتينات قيد التحقيق.
The authors have nothing to disclose.
ويتم تمويل هذا البحث من قبل لجنة نهر الميكونج والمنح BBSRC. نشكر أجاتا Zieba وPardalis كاترينا في مختبر أولف Landegren ، وجامعة أوبسالا عن المساعدة في إعداد وتقديم المشورة التقنية المفيدة. Olink Biosience للمساعدة التقنية والعرض.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |