Hier zeigen wir, wie Proximity Ligation Assay (PLA), mit einer Kombination von Antikörpern zu verwenden, um Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Signalisierung in fixierten Zellen sichtbar zu machen. Diese Technik erlaubt es uns, die nukleare Anreicherung von endogenen BMP aktivierten Effektor-Komplexe folgen und zu quantifizieren, ihre Werte im Laufe der Zeit unter BMP4 Stimulation.
BMPs sind verantwortlich für eine Vielzahl von Entwicklungs-und biologische Wirkungen. BMP-Rezeptoren aktivieren (phosphorylieren) die Smad1/5/8 Effektoren, die dann einen Komplex mit Smad4 und translozieren in den Zellkern, wo sie fungieren als Transkriptionsfaktoren an BMP spezifischen nachgelagerten Effekte 1 einzuleiten. Traditionelle Immun-Fluoreszenz-Verfahren mit Antikörpern gegen Phospho-Smad Peptide weisen eine geringe Empfindlichkeit, hohe Hintergrund und bieten grobe Quantifizierung, wie sie auf die Intensität des Antikörpers Signal besonders berufen, wenn dies lichtempfindliche fluoreszierend. Darüber hinaus können phospho-Smads nicht alle im Komplex mit Smad4 und engagiert in der aktiven Transkription.
In situ PLA ist eine Technologie zum Aufspüren von Protein-Interaktionen mit hoher Spezifität und Sensitivität 2-4. Diese neue Technologie Paare Antikörper-Erkennung mit der Amplifikation von DNA-Surrogat des Proteins. Es erzeugt eine lokalisierte, diskrete Signal in einer Form von Flecken enthüllt die genaue Position der Anerkennung Veranstaltung. Die Anzahl der Signale gezählt und verglichen die Bereitstellung einer Messung. Wir wandten in situ PLA, mit dem DuoLink-Kit, mit einer Kombination aus Antikörpern, die den Nachweis der BMP-Signalweg Effektoren phospho-Smad1/5/8 und Smad4 erlaubt nur, wenn diese in der Nähe, dh in einem Komplex, der tritt nur bei Signalisierung Aktivierung. Dieses zum ersten Mal, die Visualisierung und Messung der endogenen BMP-Signalweg mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit in einem zeitlichen Verlauf Experiment unter BMP4 Stimulation erlaubt.
Die Visualisierung von Protein-Komplexe in situ ist in der großen Nachfrage, insbesondere für Studien in die signalisieren, wo Protein-Interaktion und Modifikation von Proteinen der bedeutet, dass Zellen für das Senden eines Signals von der Oberfläche zum Kern sind. Es war nicht möglich, zu visualisieren und zu quantifizieren Komplexen zwischen zwei endogene Proteine in situ mit Immunfluoreszenz vor. Co-Lokalisation von Antikörper weist eine geringe Auflösung und kann nicht verwendet werden, um echte Interaktion zu visualisieren. PLA ist eine neue Technik, die Forscher haben begonnen, mit in verschiedenen Systemen mit großem Erfolg 6, 7. Hier zeigen wir, wie PLA Nutzung nicht nur zu visualisieren, sondern auch zu quantifizieren endogenen Komplexen zwischen Smad Effektoren stromabwärts von BMP Stimulation im Laufe der Zeit aktiviert. Wir verwendeten verschiedene Gewebekulturzellen einschließlich Neuro2a und verließ sich auf kommerzielle Antikörper in verschiedenen Spezies (Maus a-Smad4 und Kaninchen aP-Smad1/5/8) angehoben, um diese (Abb. 1) zu erreichen. Diese Methode erlaubt uns, zum ersten Mal, um die Aktivierung von BMP-Effektor-Komplexe im Laufe der Zeit zu sehen und nicht nur die Anwesenheit des phosphorylierten Smad1/5/8, die nicht alle können in aktive Komplexe mit Smad4 engagieren. Wir zählten die Signale (Abb. 1F) und im Vergleich der Messung mit der Quantifizierung von Immunoblot der gleichen Zellen 8 (Abb. 1G) erhalten. Wir schlossen daraus, dass die Zahl der Stellen eine genaue vergleichende Messung der Signal-Niveau im Laufe der Zeit geben. Die Technik wurde auch bei anderen Zelllinien (HEK293T und Cos7) mit ähnlichen Ergebnissen (Daten nicht gezeigt) aufgebracht.
Das Prinzip der Technologie basiert auf zwei einzigartige Sonden mit den DuoLink Kit bereitgestellt werden. Jeder PLA Sonde besteht aus einem sekundären Antikörper an einer einzigartigen synthetischen Oligonukleotid, welches als Reporter fungiert. Die Nähe der Sonden ermöglicht DNA Ligation an den genauen Ort, wo diese Sonden in der Nähe angebracht werden. Der Abstand der Oligonukleotide, die DNA-Hybridisierung und Ligation ist klein (<40nm) und ermöglicht somit, kann nur Proteine, die interagieren können Ligation. Die ligierten DNA kann dann verstärkt und detektiert werden mit Hybridisierung von markierten Oligonukleotiden der amplifizierten Sequenz. Die Verstärkung ist spezifisch, wie es auf DNA-DNA-Hybridisierung Prinzipien abhängt und auch eine hohe Empfindlichkeit der ligierten DNA Mehrfaches was zu Verbesserung des ursprünglichen Ligationsereignis verstärkt wird. Die amplifizierte DNA wird durch Hybridisierung mit markierten Oligonukleotiden erkannt und erzeugt einen sichtbaren und ziemlich großen Fleck. Da die Spots gezählt werden kann, bietet der PLA-Signal nicht nur die exakte räumliche Informationen (Ort der Interaktion Ereignisse), sondern auch eine objektive Möglichkeit zur Quantifizierung dieser Ereignisse 2-4.
Andere Techniken, die für die Detektion von Protein-Interaktionen eingesetzt werden, sind Co-Immunopräzipitation, Immunfluoreszenz und Fluorescent Resonance Energy Transfer (FRET). Co-Immunpräzipitationsassays sind weit verbreitet ermöglicht die Isolierung von Protein-Komplexen. Das Verfahren ist durch Immunoblot was bedeutet, dass die Proteine auf relativ hohem Niveau ausgedrückt werden muss, um erkannt zu werden begleitet. Probleme der hohen Hintergrund oder unspezifische Bindung von einigen Proteinen, die Perlen sind manchmal schwer zu in Co-Immunopräzipitation zu überwinden. Darüber hinaus ermöglichen Co-Immunopräzipitation Assays zum Nachweis von Proteinen, die Teil eines Protein-Komplex werden können, aber nicht unterscheiden kann, diejenigen, die in unmittelbarer Nähe physikalisches Zusammenwirken mit einander sind. Darüber hinaus können Co-Immunpräzipitationen keine Quantifizierung in einzelne Zelle Auflösung oder Informationen über die Lokalisation der Protein-Komplexe in der Zelle. Nachweis der Koexistenz von Proteinkomplexen in einer Zelle oder einem Zell-Kompartiment durch Immunfluoreszenz auf die Überlappung von diffusen Signalen beruht und daher eine geringe räumliche Auflösung und kann keine genauen Informationen über Protein-Interaktionen. Die Quantifizierung der Immunfluoreszenz-Signal kann durch visuelle Abschätzung erfolgen nur, wenn der Unterschied ist ein Mehrfaches, und kann nicht richtig oder messbar wie die PLA-Spots. FRET ermöglicht die Visualisierung von Proteinkomplexen in lebenden Zellen und überwindet die Notwendigkeit für Antikörper und die Exposition des Epitops. Allerdings FRET in der Regel abhängig von der Überexpression von künstlichen Fusionsproteine, die nicht widerspiegeln kann das endogene Protein-Komplexen, wie in der PLA.
Blocking Bedingungen in der PLA-Protokoll sind wichtig, denn Antikörper Aggregation auftreten und erhöhen den Hintergrund. Alternative blockiert Bedingungen können in Antikörper-Produkt zu entnehmen. Entsprechende Kontrollen mit primären und sekundären Antikörper Unterlassung liefern Informationen darüber, was kann falsch gelaufen sein und sie müssen immer aufgenommen werden. Es ist wichtig, verschiedene Antikörper, die am wenigsten Hintergrund, wenn sie allein verwendet werden und das beste Signal geben wird, wenn sie zusammen Bildschirm. Fixation von cells ist wichtig, da über die Festsetzung kann Protein-Komplexe vollständig denaturiert und abgebaut, während unzureichende Fixierung kann zum Verlust der Protein-Komplexen während der Schritte des Verfahrens führen. Dies kann durch eine Senkung der Konzentration des Fixiermittels 3% oder durch eine Begrenzung der Fixierung gesteuert werden. Allerdings hängt die Fixierung auch davon ab, ob der primäre Antikörper erkennen denaturierte Proteine oder nicht. Da die PLA Technik ist sehr empfindlich sind, ist besondere Sorgfalt erforderlich, um die Inkubationszeiten und Mikro Bedingungen gleich zwischen den verschiedenen Proben zu halten.
Die Proben sollten nicht nach links auf jeden Fall vor dem letzten Schritt zu trocknen. Trocknung der Proben kann zu einer erhöhten Hintergrund führen. Die vollständige Entfernung der Blockierungslösung ist auch entscheidend, um Hintergrund zu vermeiden. Der Waschpuffer sollte immer vor dem Gebrauch Raumtemperatur gebracht werden, wie niedrige Temperatur verlangsamt sich die enzymatischen Reaktionen. Für weitere Informationen zur Fehlerbehebung, um das Handbuch des Kit beziehen.
Es ist nützlich, um Flecken zu verwenden, um die subzelluläre Lokalisation der PLA-Signal (zB DAPI, Aktin etc) zu ermitteln. Hier haben wir DAPI (in der Montage-Medium) benutzt, um die Kerne zu färben. PLA ist kompatibel mit der Verwendung von Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen Zelltyp oder zellulären Kompartiment (hier nicht dargestellt) zu bestimmen. Genaue Quantifizierung kann durch Zählen der Signale und die Verwendung einer bestimmten Software (DuoLink Image Tool, Olink Biosience) durchgeführt werden.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie man in situ PLA zu verwenden, mit dem DuoLink Kit zum Nachweis BMP-Signalweg in fixierten Zellen und präsentierte seine Vorteile: einfach zu bedienen, sehr empfindlich, keinen Hintergrund, und eine einzigartige Fähigkeit zur aktiven BMP quantifizieren Signalisierung in situ.
Die Begrenzung der Anwendung dieser Technik auf verschiedene Protein-Interaktionen zu studieren, hängt von der Verfügbarkeit und Qualität der primären Antikörper, die die Proteine erkennen untersucht.
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wird von der MRC und der BBSRC Zuschüsse. Wir bedanken uns bei Agata Zieba und Katerina Pardalis in Ulf Landegren Lab, Universität Uppsala für die Hilfe bei der Einrichtung der Technik und nützliche Ratschläge. Olink Biosience für technische Hilfe und die Präsentation.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |