כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.
BMPs אחראים מגוון רחב של השפעות ביולוגיות התפתחותיים. קולטנים BMP להפעיל (phosphorylate) Smad1/5/8 effectors, אשר לאחר מכן, בצורה מורכבת עם Smad4 ו translocate לגרעין שם הם מתפקדים גורמי תעתוק ליזום השפעות BMP במורד ספציפי 1. מסורתית חיסונית הקרינה טכניקות עם נוגדנים נגד phospho-Smad פפטידים התערוכה רגישות נמוכה, רקע גבוה להציע כימות ברוטו כפי שהם מסתמכים על עוצמת האות נוגדן במיוחד אם זה רגיש לאור ניאון. בנוסף, phospho-Smads לא יכול כל להיות מורכב עם Smad4 ועסק שעתוק פעיל.
באתרו PLA היא טכנולוגיה מסוגל לאתר אינטראקציות חלבון עם סגוליות גבוהה ורגישות 2-4. זו טכנולוגיה חדשה לזוגות נוגדן הכרה עם הגברה של פונדקאית DNA של החלבון. זה יוצר אות מקומי, דיסקרטי בצורה של כתמים לחשוף את המיקום המדויק של האירוע הכרה. מספר אותות ניתן לספור והשוו מתן המדידה. אנו ליישם PLA באתרו, באמצעות ערכת Duolink, עם שילוב של נוגדנים המאפשר זיהוי של effectors איתות BMP ו phospho-Smad1/5/8 Smad4 רק כאשר אלה נמצאים בסמיכות כלומר במתחם, אשר מתרחשת רק עם איתות ההפעלה. זו אפשרה, לראשונה, את להדמיה ומדידה של BMP אנדוגני איתות עם ייחוד רגישות גבוהה בניסוי הזמן כמובן תחת גירוי BMP4.
ויזואליזציה של קומפלקסים חלבונים באתרו הוא ביקוש רב, במיוחד ללימודי איתות שבו אינטראקציה חלבון חלבון שינוי הם האמצעים כי התאים לשימוש שולח איתות מפני השטח שלהם לגרעין. זה לא היה ניתן לחזות ולכמת קומפלקסים בין שני חלבונים אנדוגניים באתרו עם immunofluorescence לפני. Co-לוקליזציה של נוגדנים מוצגים ברזולוציה נמוכה ולא ניתן להשתמש בהם כדי לחזות אינטראקציה אמיתית. PLA היא טכניקה חדשה כי החוקרים התחילו להשתמש במערכות שונות בהצלחה רבה 6, 7. כאן, אנו מדגימים כיצד להשתמש PLA לא רק לדמיין אלא גם לכמת מתחמי אנדוגני בין effectors Smad מופעל הזרם לאורך זמן של גירוי BMP. השתמשנו שונים כולל תאים בתרבית רקמה Neuro2a ו הסתמכה על נוגדנים מסחרי וגדל מינים שונים (עכבר ו-Smad4 ארנב aP-Smad1/5/8) כדי להשיג את זה (איור 1). שיטה זו אפשרה לנו, בפעם הראשונה, כדי לראות את ההפעלה של BMP-מתחמי מפעיל לאורך זמן ולא רק את נוכחותם של Smad1/5/8 פוספורילציה, אשר לא יכול להיות כל העוסקים מתחמי פעיל עם Smad4. ספרנו את האותות (תאנה 1F) והשווה את המדידה עם כימות המתקבל immunoblot של תאים באותו 8 (דמות 1G). הגענו למסקנה כי מספר המקומות מספקים מדידה השוואתית מדויקת של איתות רמות לאורך זמן. השיטה יושמה גם על שורות תאים אחרים (HEK293T ו Cos7) עם תוצאות דומות (מידע לא מוצג).
העיקרון של הטכנולוגיה מבוססת על שתי בדיקות ייחודי המסופק עם ערכת Duolink. כל בדיקה PLA מכיל נוגדנים משני המחובר oligonucleotide סינתטי ייחודי, אשר משמש ככתב. קרבתו של בדיקות ה-DNA מאפשר קשירת על המיקום המדויק שבו אלו בדיקות מחוברים בסמיכות. המרחק של oligonucleotides, המאפשר הכלאה דנ"א קשירת קטן (40nm <) ולכן, חלבונים רק כי אינטראקציה יכולה להרשות קשירת. הדנ"א ligated אז יכול להיות מוגבר מזוהה עם הכלאה של oligonucleotides שכותרתו רצף מוגבר. הגברה הוא ספציפי כמו זה תלוי DNA-DNA עקרונות ההכלאה וגם מספק רגישות גבוהה כמו ה-DNA ligated מוגבר פי כמה וכתוצאה מכך שיפור של האירוע קשירת הראשונית. דנ"א מוגבר הוא זוהה על ידי הכלאה עם oligonucleotides שכותרתו ומייצרת מקום גלוי גדול למדי. כמו כתמים ניתן לספור, את האות PLA מספק לא רק את המידע המרחבי המדויק (את המיקום של האירועים אינטראקציה), אלא גם דרך לכימות אובייקטיבי של האירועים הללו 2-4.
טכניקות אחרות, כי הם מועסקים לצורך זיהוי של אינטראקציות חלבון כוללים שיתוף immunoprecipitation, immunofluoresence ו תהודה פלורסנט העברת אנרגיה (סריג). Co-immunoprecipitation מבחני נמצאים בשימוש נרחב המאפשר בידוד של קומפלקסים חלבונים. השיטה מלווה immunoblotting כלומר חלבונים חייב לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות יחסית כדי להיות מזוהה. בעיות רקע גבוה או שאינו ספציפי המחייב של חלבונים מסוימים החרוזים הם לפעמים קשה להתגבר immunoprecipitation שיתוף. בנוסף, שיתוף immunoprecipitation מבחני לאפשר זיהוי של חלבונים יכולה להיות חלק ממכלול חלבון אך אינה יכולה להבחין אלה נמצאים בסמיכות פיזית מאוד באינטראקציה אחד עם השני. יתר על כן, שיתוף immunoprecipitations לא יכול לספק quantitation ברזולוציה תא יחיד או מידע על לוקליזציה של קומפלקסים חלבונים בתא. איתור של דו קיום של קומפלקסים חלבונים בתא או תא תא על ידי immunofluoresence מבוססת על חפיפה של אותות מתפזרת ולכן, יש ברזולוציה מרחבית נמוכה, לא יכול לספק מידע מדויק על אינטראקציות חלבון. כימות האות immunofluoresence יכול להיעשות על ידי הערכה ויזואלית רק אם ההבדל הוא פי כמה וכמה, ולא ניתן למדידה מדויקת או כמו כתמים PLA. סריג מאפשר הדמיה של קומפלקסים חלבונים בתאים חיים מתגבר הצורך נוגדנים חשיפת epitope. עם זאת, סריג בדרך כלל תלוי overexpression של חלבונים התמזגו מלאכותיים, אשר לא תשקף את קומפלקסים חלבונים אנדוגניים כפי PLA.
התנאים חסימת את פרוטוקול PLA הם קריטיים כמו צבירה נוגדנים עלולה להתרחש ולהגדיל את הרקע. התנאים חסימת אלטרנטיבית ניתן למצוא גיליונות מוצר נוגדן. בקרות מתאימות עם השמטה הנוגדן הראשוני והמשני לספק מידע על מה אולי השתבש והם צריכים להיכלל תמיד. חשוב מסך נוגדנים שונים שייתן את הרקע לפחות כאשר הם משמשים לבד את האות הטוב ביותר כאשר הם ביחד. קיבוע של cells הוא קריטי כמו מעל לתקן עלול לגרום קומפלקסים חלבונים באופן מלא לפגל ו לבזות, ואילו קיבעון מספיק עלול להוביל לאובדן של קומפלקסים חלבונים במהלך השלבים של ההליך. זה יכול להיות נשלט על ידי הפחתת הריכוז של מקבע כדי 3% או על ידי הגבלת זמן קיבעון. עם זאת, קיבעון תלוי גם בשאלה האם נוגדנים העיקרית לזהות חלבונים מפוגל או לא. כמו טכניקה PLA רגיש מאוד, טיפול מיוחד נדרש כדי לשמור על פי הדגירה ותנאי המיקרו שווה בין מדגמים שונים.
דוגמאות לא צריך להשאיר לייבוש על מקרה לפני השלב הסופי. ייבוש של הדגימות יכול להוביל רקע מוגבר. הסרה מלאה של פתרון חסימת חיוני גם כדי למנוע רקע. מאגרים לשטוף צריך תמיד להביא לטמפרטורת החדר לפני השימוש, כמו טמפרטורה נמוכה מאטה את תגובות אנזימטיות. עבור פתרון בעיות נוסף עיין במדריך של קיט.
כדאי להשתמש כתמים לברר את לוקליזציה המשנה הסלולר של האות PLA (למשל DAPI, אקטין וכו '). כאן השתמשנו DAPI (במדיום הרכבה) להכתים את הגרעינים. PLA תואם השימוש immunofluorescence עם נוגדנים כדי לקבוע את סוג התא או תא סלולרי (לא מוצג כאן). כימות מדויק יכול להיעשות על ידי ספירת אותות שימוש בתוכנות מסוימות (כלי Duolink תמונה, Olink Biosience).
לסיכום אנו הדגימו כיצד להשתמש ב-PLA באתרו, באמצעות ערכת Duolink לזהות BMP איתות בתאי קבוע והציגו יתרונות: קל לשימוש, רגיש מאוד, לא רקע, יכולת ייחודית לכמת BMP פעיל איתות באתרם.
המגבלה של החלת בטכניקה זו כדי ללמוד אינטראקציות חלבון שונה תלוי בזמינות ובאיכות של נוגדנים העיקרי לזהות את החלבונים תחת חקירה.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי MRC ואת מענקי BBSRC. אנו מודים אגתה Zieba וקתרינה Pardalis במעבדה של אולף Landegren, אופסלה על העזרה עם הקמת טכניקה ועצות שימושיות. Olink Biosience לעזרה טכנית את המצגת.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |