Qui si mostrano come utilizzare Ligation analisi di prossimità (PLA), con una combinazione di anticorpi per visualizzare proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione nelle cellule fisso. Questa tecnica ci ha permesso di seguire l'accumulo nucleare di BMP endogene attivate effettore complessi e quantificare i loro livelli nel corso del tempo sotto BMP4 stimolazione.
BMP sono responsabili di una vasta gamma di effetti sullo sviluppo e biologici. Attivare i recettori BMP (fosforilare) la Smad1/5/8 effettori, che poi, formano un complesso con Smad4 e traslocare al nucleo dove funzionano come fattori di trascrizione di avviare BMP effetti specifici a valle 1. Tradizionali tecniche di immunofluorescenza con anticorpi anti-fosfo Smad peptidi mostrano bassa sensibilità, elevato background e offrono quantificazione lordo si basano sulla intensità del segnale degli anticorpi in particolare se questa è fotosensibile fluorescenti. Inoltre, fosfo-Smads non possono essere tutti in complesso con Smad4 e impegnati nella trascrizione attivo.
In situ PLA è una tecnologia in grado di rilevare le interazioni proteina con elevata specificità e sensibilità 2-4. Questa nuova tecnologia di riconoscimento coppie di anticorpi con l'amplificazione del DNA surrogato della proteina. Si genera un localizzata, segnale discreto in una forma di macchie rivelare l'esatta posizione dell'evento riconoscimento. Il numero di segnali possono essere contate e confrontate fornendo una misurazione. Abbiamo applicato in situ PLA, utilizzando il kit Duolink, con una combinazione di anticorpi, che consente il rilevamento degli effettori segnalazione BMP phospho-Smad1/5/8 e Smad4 solo quando questi si trovano in prossimità cioè in un complesso, che si verifica solo con segnalazione attivazione. Questo ha permesso per la prima volta, la visualizzazione e la misurazione del endogene BMP segnalazione con alta specificità e sensibilità in un esperimento in corso a tempo stimolazione BMP4.
La visualizzazione di complessi proteici in situ è molto richiesto, in particolare per gli studi di segnalazione in cui l'interazione delle proteine e modificazione delle proteine sono i mezzi che le cellule utilizzano per l'invio di un segnale da loro superficie al nucleo. Non è stato possibile visualizzare e quantificare i complessi tra due proteine endogene in situ con immunofluorescenza prima. Co-localizzazione di anticorpi mostre bassa risoluzione e non può essere utilizzato per visualizzare l'interazione vera. PLA è una nuova tecnica che i ricercatori hanno iniziato a utilizzare in sistemi diversi con grande successo, 6, 7. Qui, ci dimostrano come utilizzare PLA non solo di visualizzare, ma anche di quantificare i complessi endogena tra effettori Smad attivato a valle della stimolazione BMP nel tempo. Abbiamo utilizzato cellule di coltura di tessuto differenti tra cui Neuro2a e invocato anticorpi commerciali cresciuto a specie diverse (mouse a-Smad4 e coniglio aP-Smad1/5/8) per raggiungere questo obiettivo (fig. 1). Questo metodo ci ha permesso, per la prima volta, per vedere l'attivazione di BMP effettrici complessi nel tempo e non solo la presenza del fosforilata Smad1/5/8, che non possono essere tutti impegnati in complessi attivi con Smad4. Abbiamo contato i segnali (Fig. 1F) e rispetto la misura con la quantificazione ottenute da immunoblot delle stesse cellule 8 (figura 1G). Siamo giunti alla conclusione che il numero delle macchie di fornire una misurazione accurata comparativa dei livelli di segnale nel tempo. La tecnica è stata applicata anche su altre linee cellulari (HEK293T e Cos7) con risultati simili (dati non riportati).
Il principio della tecnologia si basa su due sonde uniche fornite con il kit Duolink. Ogni sonda PLA è costituito da un anticorpo secondario collegato a un oligonucleotide sintetico unico, che agisce come reporter. La vicinanza delle sonde permette di legatura del DNA nel punto esatto in cui sono attaccati a queste sonde di prossimità. La distanza del oligonucleotidi, che permette l'ibridazione del DNA e la legatura è piccolo (40 nm <) e quindi, solo le proteine che interagiscono può permettere la legatura. Il DNA legatura possono poi essere amplificate e analizzate con ibridazione di oligonucleotidi etichetta della sequenza amplificata. L'amplificazione è specifica in quanto dipende da DNA-DNA principi di ibridazione e fornisce anche ad alta sensibilità, come il DNA è amplificato legatura diverse volte con conseguente valorizzazione della manifestazione legatura iniziale. Il DNA amplificato viene rilevato tramite l'ibridazione con oligonucleotidi etichettati e produce un luogo visibile e piuttosto grande. Come gli spot possono essere contati, il segnale di PLA fornisce non solo le informazioni esatte spaziale (la posizione degli eventi interazione), ma anche un modo obiettivo di quantificare questi eventi 2-4.
Altre tecniche che vengono impiegate per la rilevazione delle interazioni proteiche sono co-immunoprecipitazione, immunofluorescenza e fluorescente Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprecipitazione test sono ampiamente utilizzati consente l'isolamento di complessi proteici. Il metodo è accompagnato da immunoblotting che significa che le proteine deve essere espressa a livelli relativamente elevati per poter essere rilevato. I problemi di fondo alto o legame non specifico di alcune proteine ai talloni sono a volte difficili da superare in co-immunoprecipitazione. Inoltre, la co-immunoprecipitazione test permettono la rilevazione di proteine che possono essere parte di un complesso di proteine, ma non riescono a distinguere quelli che sono nelle immediate vicinanze interagire fisicamente con l'altro. Inoltre, il co-immunoprecipitazione non può fornire la quantificazione nella risoluzione singola cella o le informazioni sulla localizzazione dei complessi proteina nella cellula. Rilevazione di co-esistenza di complessi proteici in una cella o un vano cella immunofluorescenza si basa sulla sovrapposizione di segnali diffusi e, quindi, ha una bassa risoluzione spaziale e non può fornire informazioni accurate sulle interazioni delle proteine. Quantificazione del segnale di immunofluorescenza può essere fatto da stima visiva solo se la differenza è diverse volte, e non possono essere accurate o misurabili, come le macchie PLA. FRET permette la visualizzazione di complessi proteici in cellule vive e supera la necessità di anticorpi e l'esposizione della epitopo. Tuttavia, FRET di solito dipende la sovraespressione di proteine artificiali fusa, che potrebbero non riflettere l'complessi proteici endogeni come nel PLA.
Condizioni di blocco del protocollo di PLA sono critici come aggregazione degli anticorpi si possono verificare ed aumentare lo sfondo. Alternative condizioni di blocco possono essere trovati nelle schede del prodotto anticorpi. Controlli appropriati con omissione anticorpo primario e secondario di fornire informazioni su cosa possa essere andato male e hanno bisogno di essere sempre inclusi. E 'importante schermo anticorpi diversi che darà il minimo background quando vengono utilizzati da soli e il miglior segnale quando sono insieme. Fissazione di cells è critica come oltre la fissazione può causare complessi proteici a snaturare e degradare completamente, mentre la fissazione insufficiente può portare alla perdita di complessi proteici durante le fasi della procedura. Questo può essere controllato abbassando la concentrazione del fissativo al 3% o limitando il tempo di fissazione. Tuttavia, la fissazione dipende anche dal fatto che gli anticorpi primari riconoscono proteine denaturate o meno. Come la tecnica PLA è molto sensibile, particolare attenzione è necessaria per mantenere i tempi di incubazione e le condizioni micro uguali tra diversi campioni.
I campioni non deve essere lasciato ad asciugare in ogni caso prima che il passo finale. L'essiccazione dei campioni può portare a un aumento di fondo. La rimozione completa della soluzione di bloccaggio è anche fondamentale per evitare di fondo. I tamponi di lavaggio deve sempre essere portato a temperatura ambiente prima dell'uso, la temperatura bassa rallenta le reazioni enzimatiche. Per la risoluzione dei problemi consultare il manuale del kit.
E 'utile utilizzare le macchie di accertare la localizzazione sub-cellulare del segnale di PLA (per esempio DAPI, actina ecc). Qui abbiamo usato DAPI (nel mezzo di montaggio) per colorare i nuclei. PLA è compatibile con l'uso di immunofluorescenza con anticorpi per determinare il tipo cellulare o un compartimento cellulare (non mostrati qui). Quantificazione precisa può essere fatta contando i segnali e l'uso di software specifici (Image Tool Duolink, Olink Biosience).
In conclusione abbiamo dimostrato come utilizzare in situ PLA, utilizzando il kit per rilevare Duolink BMP segnalazione nelle cellule fisse e ha presentato i suoi vantaggi: facile da usare, molto sensibile, senza sfondo, e una capacità unica di quantificare attivo BMP segnalazione in situ.
La limitazione di applicare questa tecnica per studiare le interazioni delle proteine differenti dipende dalla disponibilità e qualità degli anticorpi primari che riconoscono le proteine sotto inchiesta.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è finanziata dalla MRC e le sovvenzioni BBSRC. Ringraziamo Agata Zieba e Katerina Pardalis nel laboratorio di Ulf Landegren, Università di Uppsala per aiutare con la creazione di la tecnica e utili consigli. Biosience Olink per assistenza tecnica e la presentazione.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |