Aquí se muestra cómo utilizar la ligadura de ensayo de proximidad (PLA), con una combinación de anticuerpos para visualizar la proteína morfogenética ósea (BMP) de señalización en células fijadas. Esta técnica nos permitió seguir la acumulación nuclear de endógeno BMP activa de efectos complejos y cuantificar sus niveles en el tiempo en BMP4 estimulación.
BMPs son responsables de una amplia gama de efectos sobre el desarrollo y biológicos. Activar los receptores BMP (fosforilar) la Smad1/5/8 efectores, que a su vez, forman un complejo con Smad4 y trasladar al núcleo donde funcionan como factores de transcripción para iniciar BMP efectos específicos intermedios 1. Tradicionales técnicas de inmunofluorescencia con anticuerpos contra péptidos Smad fosfo-presentan baja sensibilidad de fondo, de altura y ofrecen la cuantificación bruto ya que dependen de la intensidad de la señal de anticuerpos sobre todo si este es fotosensible fluorescentes. Además, fosfo-Smads pueden no estar todos en el complejo con Smad4 y participó en la transcripción activa.
In situ PLA es una tecnología capaz de detectar las interacciones de proteínas con alta especificidad y sensibilidad 2-4. Esta nueva tecnología de reconocimiento parejas de anticuerpos con la amplificación de ADN de un sustituto de la proteína. Se genera una señal localizada, discreta en forma de manchas de revelar la posición exacta del evento de reconocimiento. El número de señales se pueden contar y en comparación proporciona una medición. Hemos aplicado in situ PLA, utilizando el kit de Duolink, con una combinación de anticuerpos que permite la detección de los efectores de señalización BMP phospho-Smad1/5/8 Smad4 y sólo cuando estos se encuentran en la proximidad, es decir en un complejo, que ocurre sólo con la señalización activación. Esto permitió que por primera vez, la visualización y medición de los endógenos de señalización de BMP con una alta especificidad y sensibilidad en un tiempo experimento en la estimulación BMP4.
La visualización de los complejos de proteínas in situ está en gran demanda, sobre todo para los estudios en donde la interacción de proteínas de señalización y modificación de proteínas son los medios que las células usan para enviar una señal de su superficie al núcleo. No ha sido posible visualizar y cuantificar los complejos entre dos proteínas endógenas in situ con inmunofluorescencia antes. Co-localización de anticuerpos muestra de baja resolución y no se puede utilizar para visualizar una verdadera interacción. PLA es una nueva técnica que los investigadores han empezado a utilizar en diferentes sistemas con gran éxito 6, 7. En este sentido, se muestra cómo utilizar PLA no sólo para visualizar, sino también cuantificar los complejos endógenos entre efectores Smad activado aguas abajo de la estimulación BMP con el tiempo. Hemos utilizado diferentes células de cultivo de tejidos incluyendo Neuro2a y se basó en anticuerpos comerciales planteadas en las diferentes especies (ratón y conejo-Smad4 aP-Smad1/5/8) para lograr esto (fig 1). Este método nos permitió, por primera vez, para ver la activación de los efectores BMP-complejos con el tiempo y no sólo la presencia de la fosforilado Smad1/5/8, que no todos pueden participar en complejos activos con Smad4. Contamos con las señales (Fig. 1F) y se comparó la medida con la cuantificación obtenidos de inmunoblot de las mismas células 8 (Figura 1G). Llegamos a la conclusión de que el número de puntos de proporcionar una medición precisa comparativo de los niveles de señalización a través del tiempo. La técnica se aplicó también en otras líneas celulares (HEK293T y COS7) con resultados similares (datos no mostrados).
El principio de la tecnología se basa en dos sondas únicos incluidos en el kit Duolink. Cada sonda PLA consiste en un anticuerpo secundario unido a un oligonucleótido sintético único, que actúa como un periodista. La proximidad de las sondas permite la ligadura de ADN en el lugar exacto donde estas sondas se unen en la proximidad. La distancia de los oligonucleótidos, que permite la hibridación de ADN y la ligadura es pequeño (40 nm <) y por lo tanto, sólo las proteínas que interactúan puede permitir que la ligadura. El ADN ligado entonces puede ser amplificado y detectado con la hibridación de los oligonucleótidos etiqueta de la secuencia amplificada. La amplificación es específica, ya que depende de los principios de hibridación ADN-ADN y también proporciona una alta sensibilidad como el ADN ligado se amplifica varias veces que resulta en la mejora de la ligadura de evento inicial. El ADN amplificado se detecta por hibridación con oligonucleótidos marcados y produce un lugar visible y bastante grandes. Medida que los puntos se puede contar, la señal de PLA no sólo proporciona la información exacta espaciales (la ubicación de los eventos de interacción), sino también una manera objetiva de cuantificar estos eventos 4.2.
Otras técnicas que se emplean para la detección de interacciones de proteínas incluyen co-inmunoprecipitación, inmunofluorescencia y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET). Co-immunoprecipitation ensayos son ampliamente utilizados que permite el aislamiento de los complejos de proteínas. El método se acompaña de inmunotransferencia lo que significa que las proteínas se expresan en niveles relativamente altos a fin de detectar. Los problemas de fondo de alta o de la unión no específica de algunas proteínas de los granos son a veces difíciles de superar en co-inmunoprecipitación. Además, co-immunoprecipitation ensayos permiten la detección de proteínas que pueden formar parte de un complejo de proteínas, pero no pueden distinguir aquellos que están en una proximidad muy cercana interactuar físicamente con los demás. Además, co-inmunoprecipitaciones no puede proporcionar la cuantificación en la resolución de celda o de información sobre la localización de los complejos de proteínas en la célula. La detección de co-existencia de complejos de proteínas en una célula o un compartimento de células por inmunofluorescencia se basa en la superposición de las señales de difusión y por lo tanto, tiene una resolución espacial baja y no puede proporcionar información precisa sobre las interacciones de las proteínas. La cuantificación de la señal de inmunofluorescencia se puede hacer por estimación visual sólo si la diferencia es de varias veces, y no puede ser exacta o medibles como las manchas de PLA. FRET permite la visualización de los complejos de proteínas en células vivas y evita la necesidad de anticuerpos y la exposición del epítopo. Sin embargo, FRET lo general depende de la sobreexpresión de proteínas de fusión artificial, lo cual no refleja los complejos de proteínas endógenas como en el PLA.
Condiciones de bloqueo en el protocolo de PLA son fundamentales como la agregación de anticuerpos puede ocurrir y aumentar el fondo. Distintas condiciones de bloqueo se puede encontrar en las fichas técnicas de anticuerpos. Los controles adecuados con omisión del anticuerpo primario y secundario proporcionan información sobre lo que pudo haber salido mal y que necesitan estar siempre incluido. Es importante a la pantalla de anticuerpos diferentes que le dará al menos de fondo cuando se emplean solos y la mejor señal cuando están juntos. La fijación de cells es crítico ya que más de la fijación puede causar complejos de proteínas para desnaturalizar completamente y se degradan, mientras que la fijación insuficiente puede conducir a la pérdida de complejos de proteínas durante las etapas del procedimiento. Esto puede ser controlado mediante la reducción de la concentración del fijador al 3% o al limitar el tiempo de fijación. Sin embargo, la fijación depende también de si los anticuerpos primarios reconocer proteínas desnaturalizadas o no. A medida que la técnica de PLA es muy sensible, requiere de cuidados especiales para mantener los tiempos de incubación y las condiciones micro iguales entre las diferentes muestras.
Las muestras no deben dejarse secar, en cualquier caso antes de la etapa final. Secado de las muestras puede dar lugar a un aumento de fondo. La remoción completa de la solución de bloqueo también es fundamental para evitar el fondo. Los tampones de lavado debe estar siempre a temperatura ambiente antes de su uso, como la temperatura baja retarda las reacciones enzimáticas. Para la solución de problemas, consulte el manual del kit.
Es útil el uso de las manchas para determinar la localización subcelular de la señal de PLA (por ejemplo, DAPI, la actina, etc.) Aquí hemos utilizado DAPI (en el medio de montaje) para teñir los núcleos. PLA es compatible con el uso de inmunofluorescencia con anticuerpos para determinar el tipo de células o compartimento celular (no mostrado aquí). Cuantificación exacta se puede hacer contando las señales y el uso de software específico (Herramienta Duolink imagen, Olink Biosience).
En conclusión, hemos demostrado cómo utilizar in situ PLA, utilizando el kit de Duolink para detectar la señalización de BMP en células fijadas y presentó sus ventajas: fácil de usar, altamente sensible, no de fondo, y una capacidad única para cuantificar los activos de señalización de BMP en el lugar.
La limitación de la aplicación de esta técnica para estudiar las interacciones de diferentes proteínas depende de la disponibilidad y la calidad de los anticuerpos primarios que reconocen las proteínas objeto de la investigación.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación está financiada por el MRC y las subvenciones BBSRC. Damos las gracias a Agata Zieba y Pardalis Katerina en el Laboratorio de Ulf Landegren de la Universidad de Uppsala para ayudar con la creación de la técnica y consejos útiles. Olink Biosience para la ayuda técnica y la presentación.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
GMEM | Invitrogen | 21710025 | ||
DMEM | Invitrogen | 21063029 | ||
FBS | AutogenBioclear | 7.01 | ||
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11149068 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | ||
Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-054 | ||
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | ||
16-well chamber slides | Lab-Tek | 178599 | ||
Polysine | VWR | 631-0107 | ||
Cover glass | VWR | 631-0138 | ||
a-pSmad1/5/8 | Cell Signaling | 9511 | ||
a-Smad4 (B8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7966 | ||
Dorsomorphin | Merck | 171260-10MG | ||
Recombinant Mouse BMP-4 | R&D | 5020-BP-010 | ||
PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | ||
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | ||
Tween-20 | Promega | H5151 | ||
Duolink II Detection Reagents (Orange) | OLINK | 92007-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS | Olink Bioscience | 92004-0100 | ||
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS | Olink Bioscience | 92002-0100 | ||
Duolink II Mounting Medium with DAPI | Olink Bioscience | 82040-0005 | ||
Duolink II Wash Buffers Fluorescence | Olink Bioscience | 82049 |