Abbiamo descritto un protocollo per osservare e analizzare le traiettorie delle cellule che rotola su asimmetrici recettore fantasia substrati. I dati risultanti sono utili per l'ingegneria del recettore-fantasia substrati per etichette senza separazione delle cellule e l'analisi.
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Articolo metodologico
Studiare Traiettorie cellulare Rolling Patterns Receptor asimmetrica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Spostamento laterale delle cellule ortogonale a un flusso di flusso di laminazione su modelli asimmetrici recettore rappresenta un'opportunità per lo sviluppo di nuovi dispositivi per l'etichetta senza separazione e l'analisi delle cellule 1. Tali dispositivi possono utilizzare spostamento laterale per flusso continuo di separazione, o schemi di recettori che modulano l'adesione di distinguere tra diversi fenotipi cellulari o livelli di espressione del recettore. Capire la natura delle traiettorie delle cellule rotolamento sul recettore modellata substrati è necessario per l'ingegneria dei substrati e progettazione di tali dispositivi.
Qui, dimostriamo un protocollo per lo studio delle traiettorie delle cellule che rotola su modelli asimmetrici recettore che sostengono l'adesione cellulare rotolamento 2. Ben definito, micron scala modelli di P-selectina recettori sono stati fabbricati usando stampa microcontact su oro rivestite diapositive che sono state incorporate in una camera di flusso. HL60 cellule che esprimono il PSGL-1 ligando 3 erano scorreva attraverso un campo di linee a motivi geometrici e visualizzati su un microscopio invertito in campo chiaro. Le cellule laminati e tracciati lungo i bordi inclinati dei modelli, con conseguente flessione laterale 1. Ogni cella tipicamente arrotolato per una certa distanza lungo i bordi modello (definito come la lunghezza di tracciamento bordo), staccato dal bordo, e riattaccato a un modello a valle. Anche se questo distacco rende difficile tenere traccia l'intera traiettoria di una cellula dall'entrata all'uscita della camera di flusso, di tracciamento di particelle-software è stato utilizzato per analizzare le traiettorie e la resa rotolamento delle cellule durante il periodo in cui si muovevano su un solo recettore con motivi di linea. Le traiettorie sono stati poi esaminati al fine di ottenere la distribuzione delle velocità di rotolamento delle cellule e le lunghezze di margine di monitoraggio per ogni cella per diversi modelli.
Questo protocollo è utile per quantificare le traiettorie delle cellule che rotola su modelli di recettori e relativi a questi parametri di ingegneria come l'angolo pattern e sforzo di taglio. Tali dati saranno utili per la progettazione di dispositivi microfluidici per l'etichetta senza separazione delle cellule e l'analisi.
Protocollo
1. HL60 cellula rotolamento
1.1. Fabbricazione di Patterned substrati.
- Utilizzando stampa microcontact (μCP) 4-7 per rendere alternati monostrati auto-assemblati (SAM) di molecole di PEG sull'oro rivestita vetrini: Realizzare microcontatto stampa polidimetilsilossano (PDMS) francobolli che ha definito i modelli recettore con angolo di inclinazione α = 10 ° con uno SU-8 processo di stampaggio. Pulire la superficie d'oro con soluzione piranha (3:1 miscela di acido solforico al 30% di perossido di idrogeno) per 20 minuti e risciacquare la superficie con abbondante acqua deionizzata a 24,5 ° C prima dell'uso. Dell'inchiostr....
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Discussione
Abbiamo descritto un protocollo per esaminare le cellule che rotola su traiettorie asimmetriche recettore fantasia superfici fabbricate utilizzando stampa microcontact 2. Le immagini al microscopio ottico di superficie modellata che mostra il contrasto evidente tra PEG e P-selectina aree possono essere usati per confermare se stampaggio è successo. Sharp, bordi dritti si può osservare quando la timbratura viene eseguita bene. Dura pressione del bollo può causare deformazioni timbro che limita la precisione de.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto dal Centro Deshpande per l'Innovazione Tecnologica del MIT (RK e JMK) e il premio alla carriera NSF 0.952.493 di RK attraverso la chimica e biologica programma Separazioni. Ringraziamo l'Istituto per le Nanotecnologie Soldier (ISN) e il Microsystems Technology Laboratory (MTL) al MIT per l'utilizzo dei loro impianti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule di leucemia promielocitica umana | ATCC | CCL-240 | Cellule HL60 |
| Vetrini di vetro rivestiti d'oro | EMF | TA134 | Vetrini d'oro |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| P-selectina umana ricombinante | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectina |
| Albumina sierica bovina | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Soluzione salina fosfato di Dulbecco’s | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Acido solforico | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Perossido di idrogeno | Sigma-Aldrich | 316989 |
Riferimenti
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R.
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Ristampe e permessi
