双光子成像内已发现的基础条件下的淋巴结和淋巴细胞的活力和细胞相互作用过程中的免疫反应1。在这里,我们证明收养的T细胞,淋巴结的隔离和成像蠕动的CD4 + T细胞在explanted淋巴结转移。
双光子成像揭示了一个优雅的芭蕾舞蹈艺术的活力和细胞相互作用,在基础条件下的淋巴结,并启动免疫反应1。在这里,我们目前继转移标记的T细胞,淋巴结肿大隔离,成像蠕动的CD4 + T细胞在explanted淋巴结作为第一个在2002年2的方法。双光子成像需要的免疫细胞,细胞荧光标记,与细胞跟踪染料染色,或表达一种荧光蛋白。我们展示的注射细胞过继转移的过程,从供体小鼠的尾静脉进入收件人的动物,在那里,他们家约15-30分钟内淋巴器官。我们说明了一个淋巴结的隔离和描述方法,以确保正确安装切除淋巴结。其他考虑因素,如适当的氧合灌注介质,温度,激光功率进行了讨论。最后,我们目前的3D视频影像的幼稚CD4 + T细胞参展稳态活力在37 ° C。
在这个视频协议,我们将展示收养细胞转移和淋巴结成像在周围淋巴结淋巴细胞活力所需的隔离和准备程序。双光子成像有几个方面的共焦成像的优势,都explanted组织(如图所示),并在活体准备。值得注意的是,使用红外线激发,减少了光散射和淋巴结的囊下的成像〜300微米,允许在一些组织4更深。此外,多光子激发被限制的客观的焦点,最大限度地减少照片的褪色和组织损伤出方焦平面。然而,正如任何新技术,双光子成像是不是万能的,它的局限性和潜在的隐患,必须保持头脑5。其中之一是,要求 – 除了利益的胶原蛋白细胞,如二次谐波产生的内在信号必须由外在探头荧光标记或荧光蛋白的表达。因此,给人的印象是这些标记的细胞在一个黑色的虚空游泳;而事实上,他们都沉浸在和一个复杂的环境中的结构元素和无数其他的未标记的,无形的细胞交互。
在双光子成像介绍免疫以来的六年中,这种技术允许研究人员直接在可视化的完整的活组织的过程,包括细胞间的相互作用,细胞运动和本地化,细胞信号通路和细胞毒性细胞,以解决长期存在的问题杀害事件。领域已经超出最初的现象学描述的迅速发展,并与计算机建模和仿真定量分析,现在开始做出显然是混乱的蜂窝议案和淋巴结内的相互作用如何导致一个有效的免疫反应的的感觉。这种进步是全面检讨在最近出版的1,它列出了100多个描述双光子显微镜的immunoimaging应用程序文件。
我们要感谢协助试剂制备丽贝卡Paquette。 MPM是一个露丝L. Kirchstein predoctoral奖学金的赠款GM – 41514(MDC),NS – 48252(KGC),GM – 48071也从美国国立卫生研究院(IP)的健康和支持国家机构的支持。