肺のエンジニアリングのための手順

Summary

私たちは、脱細胞肺癌細胞外マトリックスと機能的な肺組織を生成するために使用することができる新規バイオミメティックバイオリアクターを開発している。バイオリアクターにおけるマトリックスと培養に細胞を播種することにより、我々は短期間のためのin vivoで移植すると効果的なガス交換を示す組織を生成する。

Abstract

肺がんや慢性閉塞性肺疾患などの慢性肺疾患、毎年いくつか28万死亡の累積的にアカウントを含む肺組織、慢性閉塞性肺疾患は、現在、米国¹の死因の第4位です。この死亡率に寄与すると肺が一般的に顕微鏡、細胞レベルを超えて修理または再生成されないという事実です。したがって、変性または感染、または外科的に切除された肺組織が ​​損傷している肺組織は、機能的に生体内で置き換えられません。肺組織をin vitroで生成することができるかどうかを調べるために、我々は、無細胞肺癌細胞外マトリックス足場を生成するために細胞成分を除去する手順を用いて成体ラットから肺を治療。この足場は、気道と血管系の階層的な分岐構造だけでなく、コラーゲンIV、ラミニン、およびフィブロネクチンを含有する主に無傷の基底膜を、保持します。足場は、負圧換気と拍動性血管灌流などの肺の生理機能の重要な側面を、模倣するように設計されたバイオリアクターに取り付けられている。培養肺上皮とバイオリアクターを取り付けられた足場内の血管内皮によって、我々は、ネイティブの肺組織の表現型と同等であり、それが短い時間間隔（45〜120分）のためのガスの交換に参加することができる肺組織を生成することができます。これらの結果は有望、および肺行列のその再増殖が肺の再生のための実行可能な戦略であることが示唆されています。この可能性だけでなく、移植用の肺組織の供給を増やす努力するだけでなく、より長い期間のためのin vitroで 、以前可能であったよりも正確な微小環境での呼吸器細胞および分子生物学を研究する機会を提供します。

Protocol

1。バイオリアクターアッセンブリー細胞化と文化の両方のためのバイオリアクターの設計とアセンブリの詳細な図（s）はそれぞれ、図1と図2で提供されています。すべてのコンポーネントは、バイオリアクターの組み立て前に滅菌する必要があります。以下の特定の点に注意されています： CONNECTIONS： 動脈カニューレは、チューブの短いセグメントによってYスプリッタに接続されているルアーロックフィッティングで構成されています。ルアーロックコネクタは、灌流チューブに取り付けられており、肺動脈に縫合されていないYのセグメントは、一方向弁に接続されています。一方向弁は、その流体が管（血流と反対方向）に策定することができる指向ですが、臓器の血流中にすべての媒体が肺に流れ込む。 気管カニューレはまた、チューブとY -スプリッタにリンクされているルアーロックコネクタで構成されています。ルアーロックは、気管のタンクと主室の間に呼吸のループに接続します。気管に縫合されていないYコネクタのセグメントは、一方向弁に接続されています。一方向弁は、動脈カニューレと同じように方向づけられる。 機能： 動脈と気管カニューレの一方通行のバルブは、配管内の流れの逆転を可能にするため、気泡を除去することを可能とすることによってチューブ内に気泡をクリアするために利用されています。 "呼吸のループは、"そのような、そのメディアが別のパスへと肺の外に次のように位置する2つの一方向のバルブを、含まれています。この機能の詳細については、我々の研究室2から公表前に提供されています。 血管灌流は、ローラーポンプを用いて提供されています。培地が添付されたカニューレを介して肺動脈に灌流され、肺の血管系を介して、および肺静脈から直接培地を灌流のために策定された主なバイオリアクター、流れ込みます。 2。臓器の収穫アメリカ獣医学協会（60 mg / kgのIP）によって定められたガイドラインに従って、ペントバルビタールナトリウム過剰摂取による成人（3-6ヶ月齢）のFischer 344ラットを安楽死させる。注：ペントバルビタールソリューションは抗凝固療法のための100単位/ mlのヘパリンが含まれる。 70％エタノールで胸＆腹を吹きかけたり、拭いてください。 肺を損傷しないように注意しながら、心臓や肺を露出、胸腔を開きます。慎重に肺が撤回させる、胸腔に横隔膜を介して小さなウィンドウを作成し、その肺の拠点を公開するために水平にこの切開を展開します。垂直リブを介して2つの切開を行い、心臓と肺を露出する胸のケージを収納。 すなわち、3方活栓を除去し、1.5インチ、21ゲージ針とチューブの〜20センチメートルプランジャーとシリンジを用いて、重力の灌流システムを準備します。リングスタンドを使って動物の上に〜20センチメートルでシリンジを維持する。すべての空気が灌流チューブから削除されていることを確認します。 肺に戻ってからそれを防止する、血液を排出するために右心房をカット。肺から血液と灌流液の容易な排水を可能にするために左心房をカットすることも役立ちますが、必須ではありませんがあります。 右心室の基部に針を挿入し、PBSでヘパリンナトリウムニトロプルシドの溶液（50U/mlと1ug/ml、それぞれ）と、肺を灌流するためにコックを開く。肺動脈が灌流液で満たされることを確認し、その血液は肺からクリアしている。必要に応じて、補充追加の流体での灌流シリンジ。一般的にのみ〜10ミリリットルが必要です。 肺が血液の明確になるまで血流を継続し、血流を停止する。 できる限り首にまで、気管自由を細かく分析。気管が食道から分離されていることを確認します。心臓、肺や気管に残りのすべての接続を細かく分析し、一括して削除します。 メスやはさみを使用して、右と左心室を露出、心尖を切断。 右心室、所定の位置に縫合糸を介して肺動脈幹にカニューレを挿入する。余分な左心室組織を削除します。 場所の気管と縫合をカニューレを挿入する。両方の気管と肺動脈カニューレを気管、肺、または大血管（図1）上にねじり応力が存在しないように配置されていることを確認してください。 システム内の気泡は、臓器を介しての一定の流れを防ぐ可能性があるため、動脈カニューレ内に気泡がないことを確認してください。いくつかのケースでは、気泡が完全にこれを達成する流体flow.Toを停止することができます、PBSを含むjarに心臓/肺ブロックを置きます。任意の気泡を追い出すために心臓のカニューレに少量のPBSを注入する注射針と注射器を使用してください。 肺からできるだけ多くの空気を除去するために、PBS 4-5回で気道を肺胞洗浄。 洗浄ステップの後にsが完了すると、PBSが1ug/mlでニトロプルシドナトリウム（SNP）を含むと肺を膨らませる。気管カニューレにストッパーを入れ、溶液が肺に残っているので。同ソリューションは、肺動脈を経由して血管を通って流れるように肺の血管拡張を可能にするために、、最大30分間インキュベートすることができます。 上記の"バイオリアクターアセンブリ"で説明されているY字型カニューレ、にリンクされているルアーロック接続を使用してバイオリアクターのキャップに心臓/肺を接続します。 （図1）。 3。臓器の細胞化細胞化装置（図1）に（接続されている肺付き）キャップを接続します。肺動脈カニューレは、血流線に接続する必要があります、と気管カニューレは、フリーフロートしてください。すべての行は、空気の明確であることを確認してください。上述したように、線内の空気がdecllularizationの流体の流れを防ぐことによって、貧しい細胞化の原因となる可能性があります。システムに閉じ込められた空気はまた、細胞の生存3に悪影響を与える可能性がある場合、培養時間に持続することができます。 肺が過膨張完全ではなくなるまで、PBS / SNPと肺を膨らませる。肺が膨張している残るように即座に気管カニューレをキャップ。 〜15 mmHgの（20センチメートルH 2 Oの圧力）で少なくとも15分間、PBS / SNPと灌流肺。 15分以上後に、肺が収縮するように気管カニューレからストッパーを外します。 30分間PBS / SNPでの灌流を続ける。必要に応じて、補充PBS / SNPは灌流圧は10-15 mmHgのに維持されていることを確認する。 細胞化ソリューション（8ミリCHAPS、1MのNaCl、1 × PBSで25mMのEDTA）で灌流を開始。すべての行は、空気の明確であることを確認するために注意してください。真空システムは、吸引を提供すると便利かもしれません。 ソリューションの500ミリリットルが肺を通じて灌流するまで細胞化ソリューションで灌流。最適な圧力は、<15 mmHgの（〜20センチメートルH 2 O）である。これは通常、2.5時間が必要になります。流量は、最初に（0.2-0.5ml/minute）一般的に非常に低速であり、そして急速に約1ml/minute以上に2番目の時間の間に増加。定期的に、十分な流動性を確保、バイオリアクターから使用される細胞化の流体を除去すると肺や気管カニューレをサポートするために残って。 4。洗浄と滅菌オルガン組織培養フードに肺やバイオリアクターを転送する。細胞化液を含まれている500ミリリットル瓶を除去し、無菌のPBSの1Lまで含む殺菌した瓶に置き換えることにより、滅菌PBSで洗浄を開始。線が空気の明確であることを確認するために真空吸引を使用してください。 細胞化のためのと同様の10〜15 mmHgので血管系を介して灌流PBS、。定期的に、バイオリアクターからの廃棄物PBSを除去し、新鮮な、滅菌PBSでPBSのジャー及び/またはリフィルを交換してください。無菌操作を使用することをお勧めします。 滅菌PBSの少なくとも2.5 L、肺を潅流するまでも洗浄を続ける。 新しいPBSを含む新しい、滅菌バイオリアクターシステムに肺を転送します。全体の血流ループ全体気道の線の両方が液体で満たされていることを確認します。後続のすべてのステップは5ml/minで肺を灌流する拍動ポンプを使用します。 PBS中の0.1％過酢酸を含むPBS + 10％FBS + 10％ペン連鎖球菌の解を持つか3時間一晩灌流のいずれかを介して、足場を滅菌する。後者は、残留酸を除去するのに数時間かけて250ミリリットルPBSの3の変更で肺を洗浄が必要になります。それぞれのすすぎのために、肺は組織のすべての部分が十分にすすぎされることを保証するために灌流だけでなく、換気してください。 〜1時間または温度がベンゾナーゼの治療のための準備として、平衡になるまで10％FBS、10％ペニシリン/ストレプトマイシンを持つPBSで37℃のインキュベーターと浸み込ませるために肺を転送します。 残留DNAを除去するためにベンゾナーゼで肺を扱う： 37℃にベンゾナーゼのバッファを（試薬の表を参照）ウォーム各肺の場合は、バッファに90U/mlベンゾナーゼとベンゾナーゼのみバッファと1つの10mlの注射器を使用すると、ワン10mlのシリンジを埋める。 肺の血流を停止します。 ベンゾナーゼバッファと気道を膨らませる。 肺が収縮することができます（〜1分間）。その後、ベンゾナーゼ液で肺を膨らませる。ベンゾナーゼバッファ＆ベンゾナーゼとインフレの間に、肺に空気を注入しないようにしてください。 肺は、ベンゾナーゼを膨らま後1時間、37℃で灌流または換気なしで座ってすることができます。 PBS + 10％FBS、バイオリアクター内に既にである10％ペニシリン/ストレプトマイシン、そして一晩続けると血流を再開する。翌日、肺のいずれか4℃（最大3ヶ月間）で保存または細胞播種のために調製することができる。 細胞再生のための足場を準備するには、培養液の〜250ミリリットルでPBS / FBS /ベンゾナーゼのソリューションを交換してください。細胞が導入される前に少なくとも1時間灌流、NDは、直接播種細胞の前に新鮮な培地と交換してください。 5。 Recellularization 臓器の再シードのための細胞ソースの選択は、個々の研究者に任されています。多くの細胞のソースは、市販の集団、新たに単離した新生児や胎児肺細胞、胚性幹細胞、または市販の細胞ソースを含めて、利用することができます。これらの細胞集団のための特定の分離プロトコルは、他の場所4,5,6見つけることができます。ここで、我々はどのように種子の両方内皮および上皮細胞集団の指示を提供しています。 内皮播種： 適切な培養培地中で、希望する内皮細胞集団の懸濁液を準備する。細胞塊を除去するために40umのセルストレーナーを介してフィルタ細胞懸濁液。我々の研究室における典型的な内皮播種は培養液の60ミリリットルで約3,000万ラットの肺微小血管内皮細胞を利用するだろう。 一時的にバイオリアクターの血流のループ（図2）に組み込まれた小型のタンクに細胞懸濁液を分注する。この貯水池と全体の血流ループからチューブが気泡の明確であることを確認してください。 ローラーポンプを使用して3ml/minで肺動脈に細胞を注入する。 細胞の注入後、所望の速度でメインリアクターから再循環培地で灌流を続ける。 日常的には、灌流チューブが気泡のクリアであることを確認してください。 培地は、定期的に新鮮な培地に置き換える必要がありますが、これは多くの場合、3〜4日ごとに行われます。 上皮播種： 希望する上皮細胞集団の細胞懸濁液を準備します。当研究室では、これは通常、約50〜100000000新生ラット肺細胞で構成されています。 40umのセルストレーナーを通して人口をフィルタリングし、シリンジで培養液の15ミリリットルで一時停止。培養液の80ミリリットルと気道の貯留を埋める。 37℃の組織培養インキュベーター内バイオリアクターを配置し、換気のためにシリンジポンプを接続してください。すべての換気の線が空気の明確であることを確認してください。 気管カニューレに単一のボーラスとして細胞懸濁液の15ミリリットルを注入することにより、肺へのシードは、細胞。 すぐにシリンジポンプを使用して、単一の、ゆっくりと呼吸を始める。この呼吸は、このように約20分間続く、3ml/minuteでメインリアクターからの空気の60ミリリットルを取り出すことにより管理されています。メインリアクターでエアフィルターがすぐに細胞懸濁液を注入後、ゆっくりと呼吸を開始する前にオフにキャップされていることを確認します。 肺は（約0.5ml /分）低速の血管灌流を開始して約18hrsのために静的に座って、とすることができます。 6。器官培養血流と換気の詳細は実験計画に基づいて異なりますが、以下の点に注意されています： 内皮培養の間、血流は一般的にローラーポンプを使用して1〜3ミリリットル/分で行われます。上皮培養の間、換気は通常、シリンジポンプを使用して、1分間に1呼吸の連続的な速度で提供されています。主なバイオリアクターからの空気の5〜10ミリリットルの撤退は、一般的に通常の換気量で肺の換気をもたらすために必要です。換気時のバイオリアクターの気密性を維持する必要があるため、換気は毎日一時停止する必要があるとメインチャンバー内の空気を交換する必要があります。システム内のすべての空気は分圧で約21％が酸素である室内空気、です。バイオリアクターからの空気の5〜10ミリリットルの撤退は、（肺によって流体の5〜10ミリリットルのインスピレーションを誘導する）肺の大きさに基づいており、どのように多くの葉は、培養されている（葉をしながら、分析のためにオフに接続することができます残りの葉は）文化の中で継続する。シリンジポンプで引き出される空気の量は、培養肺のおおよその"換気量"に選ばれる。 培地は、培養中に3〜4日ごとに約変更する必要があります。 上皮と内皮の両方の共培養時に、培養組織を換気している時に私たちの研究室では通常、最初のシード4〜8日のための上皮、中の実験。内皮は、組織を灌流して換気され、どちらも後に、血流を介して播種する。 7。代表的な結果： 細胞化プロトコルが正しく実行されると、新鮮な抽出された肺は、漏洩することなく空気を保持する必要があります。液体に沈めながら、空気とそれらを膨張させることは、これを確認することができます – 空気漏れを示す任意の気泡は存在しないはずです。 （° C、およびPBSは最終的に約10ml /分で肺に流すことができるはず37℃で3時間 – その後の細胞化は、2.5の経過とともに肺に流す細胞化液の〜500ミリリットル許可する必要があります静水圧の〜15 mmHgで下の）すすぎの最後に。 0.1パーセント過酢酸とベンゾナーゼで処理した後に、肺は3ヶ月間4℃で保存することができる、とはまだrecellularizationに適して残る。 最終的な脱細胞外マトリックスは、細胞材料の完全に欠いている、とネイティブ肺の、肉眼顕微鏡および超微細構造上の特徴を保存しておく必要があります。不十分な細胞化またはリンスは、標準ヘマトキシリン​​とエオシン染色により可視化できる足場、（比較のために図3を参照）に"こだわり"残りDNAになることがあります。 肺組織の無細胞マトリックスと文化の再投入細胞は新鮮なピーターセンや同僚4つによって仕事に付随するオンラインサプリメントで説明されているように、7日齢の新生児ラットの仔から分離されている場合は、わずか10万人以上の10匹（のリットル当たり120から150百万の細胞の細胞収率を期待できます新生児あたりの細胞）。 バイオリアクターにおける細胞播種および肺のその後の培養のための最適な条件は、肺の全5葉の中でよく分散細胞を得られるはず、と細胞外マトリックス足場（図3）の約70％のカバレッジを提供する必要があります。培養細胞集団は、そのようなプロ分泌蛋白質- C（SPC）、クララ細胞分泌蛋白（CCSP）、および相対的な豊かさの順（図4）におけるアクアポリン-5（AQP）、などの主要な呼吸器細胞のマーカーに陽性となります。 図1。カニューレの位置と細胞化バイオリアクター人工肺組織の播種と培養に用いられる図2。バイオリアクター 図3。ネイティブ、脱細胞の組織学、と再移入肺 図4。鍵肺マーカーの免疫蛍光染色

Discussion

システムの最も重要な側面は、足場と培養再移入の肺を準備し、播種の過程で血管床に適用される圧力の無菌性の維持、および綿密なモニタリングを含むここに紹介。無菌性は最高の、使用前にすべての材料をオートクレーブで、間もなく植後の閉鎖系で肺をマウントし、この障壁のその後の違反を回避することによって維持されます。脱細胞マトリクスを徹底的に洗浄し、培養用の滅菌バイオリアクターに転送された後に、シリコンキャップや他のシールとの接続が妨げまたは削除しないでください。可能な限りチェックで圧力を保つために、重力によって駆動される流れが望ましい。ポンプは、流体の循環のために必要なときは、PBSで洗浄し、培養中に継続して後に始まる、我々が直接流体を圧トランスデューサーと肺動脈に入る直前に圧力を測定することをお勧めします。適用される圧力の大きさは、15mmのHgを超えないようにしてください。

Recellularizedの肺は、通常、4日から最大3週間までに至るまでの期間を変化させるための培養することができる。換気は、通常、上皮培養中に1呼吸/分の速度で印加した状態で血管灌流は一般的に、内皮培養中1〜3ミリリットル/分で行われます。複合文化の期間中、同時換気と血流が適切です。換気は、液体培地または空気のいずれかで行うことができます。

過去数十年にわたり、いくつかのグループは、in vitroで肺上皮の分化と肺微小解剖学^7,8,9、10のいくつかの側面を複製の可能性を示す重要な組織工学の作業を行っている。しかし、最近まで、肺組織を設計するためにこれらの試みの^4,5いずれも、血液および気道のコンパートメント間の分離を維持し、ガス交換に参加できることができたインプラント臓器をもたらしたなかった。説明した方法は機能的な肺組織を生成するという長期目標に​​向かってのみ最初のステップであるけれどもそのため、この作業は、移植のための利用可能な肺組織の量を増やす可能性に向けて有望なステップです。また、この作業は、組織工学、複雑な三次元構造の足場としての脱細胞外マトリックスの有効性を実証し、細胞の様々な種類の成長と生存を支える、オットらとUygunと同僚^11,12によって行われた仕事を詳しく説明。この作品は、呼吸器細胞および分子生物学の装備一式への貢献のためにも重要です。また、適切な機械的刺激を提供できるユニークな、三次元環境を提供することにより、それが急速な脱分化のアテンダントの危険を共有しないものは、より伝統的な方法¹³の実験室で培養するの齧歯類上皮時に発生する可能性がある、科学者が使用することができます細胞分化と機能の役割を果たす細胞間および細胞 – マトリックス相互作用の新たな洞察を得るために私たちのシステム。 Cortiellaのグループは初期の研究¹⁴に示されているように、様々な幹細胞集団の運命を導くために活用するとして使用する場合は、この知識は、特に強力な可能性があります。

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Euthanasia
Heparin	Sigma-Aldrich	H4784
Sodium nitroprusside	Fluka	71778
Euthasol euthanasia solution	Virbac AH	710101	390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration
Decell Solution
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
NaCl	American Bioanalytical	AB01915
EDTA	Sigma	E5134
NaOH	J.T. Baker	3722-01
1X PBS	Gibco	14190
Bioreactor Components
480 ml jar	Cole Parmer	EW-3460560
Silicone stopper, size 14	Cole parmer	EW-06298-26
Y-connectors	Cole Parmer	ED-30614-08	Used for arterial and tracheal cannulae
Silicone tubing	Masterflex	96420-14; 16	L/S 14; 16
Pressure Transducers	Edwards Lifesciences	PX-212
Check valve	Cole Parmer	EW-98553-20	One-way valve
4-way stopcocks	Edwards Lifesciences	594WSC
Syringe filter	Cole Parmer	2915-08	PTFE, 0.2μm
Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor)
500 and 1000 ml glass bottles	Corning	1395-500; -1L	Used for decell and rinsing by gravity
Benzonase Treatment
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140122
FBS	Hyclone	SH30071.03
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043	1M, pH 8.0
MgCl2	J.T. Baker	2444-01
BSA	Sigma	A9647
Benzonase Nuclease	Sigma	E1014	Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix