Medição precisa e simples do pró-inflamatórias IL-1β citocinas usando um ensaio Estimulação Sangue Total
Summary
Nós descrevemos um imunoensaio simples para medir a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1 beta de produção, em pacientes com fenótipos Autoinflamatórias. Pela ativação de células em culturas de sangue total com patógeno-padrões moleculares associados, especificamente com lipopolissacarídeo, a secreção de citocinas podem ser convenientemente avaliados em sobrenadantes de sangue total.
Abstract
Processos inflamatórios resultantes da secreção de mediadores solúveis por células do sistema imunológico, levar a várias manifestações na pele, articulações e outros tecidos, bem como a homeostase das citocinas alterada. O sistema imune inato desempenha um papel crucial no reconhecimento de patógenos e outros estímulos endógenos perigo. Uma das principais citocinas liberado por células do sistema imunológico inato é Interleucina (IL) -1. Portanto, nós utilizamos um ensaio de estimulação todo sangue para medir a secreção de citocinas inflamatórias e especificamente da citocinas pró-inflamatórias IL-1β 1, 2, 3.
Pacientes com disfunções genéticas do sistema imune inato causando síndromes Autoinflamatórias mostram uma liberação exagerada de IL 1β madura-upon estimulação com LPS sozinho. Para avaliar o componente imunológico inato de pacientes que apresentam patologias inflamatórias associadas, usamos um imunoensaio específico para detectar as respostas imunes celulares ao patógeno-padrões moleculares associados (PAMPs), tais como a endotoxina bacteriana gram-negativa, o lipopolissacarídeo (LPS ). Estes PAMPs são reconhecidos por receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), que são encontrados nas células do sistema imune inato 4, 5, 6, 7. Um sinal primário, LPS, em conjunto com um sinal secundário, ATP, é necessária para a ativação do inflammasome, um complexo multiprotein que os processos pró-IL-1β à sua forma, maduro bioativos 4, 5, 6, 8, 9, 10.
O ensaio de sangue total requer a manipulação de amostra mínima para avaliar a produção de citocinas, quando comparado a outros métodos que exigem o isolamento trabalho intensivo e cultura de populações de células específicas. Este método difere de outros ensaios de estimulação de sangue total, ao invés de diluir as amostras com uma proporção de RPMI mídia, realizamos uma contagem de células brancas do sangue diretamente do sangue total diluído e, portanto, estimular um número conhecido de células brancas do sangue na cultura 2. Os resultados deste ensaio de sangue especial toda demonstrar uma nova técnica útil na elucidação coortes paciente apresentando fisiopatologias Autoinflamatórias.
Protocol
Discussion
O ensaio de sangue total descrito é um método simples que reproduz com mais exatidão condições fisiológicas quando comparada a outras técnicas que exigem isolamento de células e processamento das amostras extensas e manipulação. Este método utiliza a Visão Cellometer com AO a contagem de células brancas do sangue em sangue total e, portanto, fornece uma maneira de padronizar as amostras com precisão com base em números de celular.
É de notar que, para este ensaio, o sangue to…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Artrite e Doenças músculo-esqueléticas e da pele do National Institutes of Health.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium Heparin Blood Collection Tubes | BD | 366480 | ||
| RPMI 1640 Media | GIBCO | 21870-100 | ||
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | ||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | Contact company for instrument information | ||
| Cellometer Cell Counting Chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | ||
| 24-well Tissue Culture Plate | Corning Costar | 3524 | ||
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | InvivoGen | tlrl-eklps | ||
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | ||
| Bio-plex 200 system | Bio-Rad | Contact company for instrument information | ||
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex assay | Bio-Rad | x-plex assays are custom made according to specified cytokines of interest |
Riferimenti
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 .
- Mariathasan, S. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 440, 228-232 (2006).
- Gabay, C., Lamacchia, C., Palmer, G. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nat Rev Rheumatol. 4, 232-241 (2010).
- Franchi, L., Elgenbrod, T., Muñoz-Planillo, R., Nuñez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat Immunol. 3, 241-247 (2009).
- Sims, J. E., Smith, D. E. The IL-1 family: regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 2, 89-102 (2010).
- Haug, R., Joø, G. B., Westvik, A. B., Kierulf, P. Chemokine production and pattern recognition receptor (PRR) expression in whole blood stimulated with pathogen-associated molecular patterns (PAMPs. Cytokine. 32, 304-315 (2005).
- Netea, M. G. Differential requirement for the activation of the inflammasome for processing and release of IL-1bin monocytes and macrophages. Blood. 113, 2324-2335 (2009).
- Latz, E. The inflammasomes: mechanisms of activation and function. Curr Opin Immnol. 22, 28-33 (2010).
- Masters, S. L., Simon, A., Aksentijevich, I., Kastner, D. L. Horror autoinflammaticus: the molecular pathophysiology of autoinflammtory disease. Annu Rev Immunol. 27, 621-668 (2009).
