الوسم نسب خلايا اسماك الزرد مع فلوريسئين الليزر ديكستران Uncagable
Summary
ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لتسمية وتتبع مصير مجموعات صغيرة من الخلايا باستخدام الأجنة الزرد للأشعة فوق البنفسجية من uncaging فلوريسئين قفص ، يليه جبل بأكمله immunolabeling لتضخيم إشارة من فلوريسئين uncaged.
Abstract
وتتمثل المشكلة الرئيسية في البيولوجيا التطورية هو استدلال على الأصل من عدد لا يحصى من أنواع الخلايا الموجودة في الفقاريات لأنها تنشأ من السلائف غير متمايزة. الباحثون قد استخدمت أساليب مختلفة لوضع العلامات النسب ، مثل وضع العلامات الجاذبة (1) وحقن ضغط الانزيمات يمكن عزوها 2 إلى مصير الخلية التحقق في مراحل لاحقة من تطور في نظم النموذج. تم تجميع الخرائط مصير الاولى في الزرد (دانيو rerio) عن طريق الحقن iontophoretic من الأصباغ الفلورية ، مثل ديكستران رودامين ، إلى خلايا في مناطق منفصلة واحدة من الجنين وتتبع مصير الخلية المسمى على مر الزمن 3-5. في حين فعالة ، وهذه الأساليب يطالبون تقنيا وتتطلب معدات متخصصة لا توجد عادة في المختبرات الزرد. في الآونة الأخيرة ، والبروتينات الفلورية photoconvertable ، مثل إيوس Kaede الذي والذي لا رجعة فيه التبديل من الأخضر إلى الأحمر عند تعرضها مضان للأشعة فوق البنفسجية ، نشهد زيادة في استخدام الزرد 6-8. جعلت من الوضوح البصري للجنين الزرد والسهولة النسبية لهذه الأدوات transgenesis جاذبية خاصة لوضع العلامات ونسبها لمراقبة الهجرة من الخلايا في الجسم الحي 7. على الرغم من فائدتها ، وهذه البروتينات وبعض العيوب مقارنة صبغ بوساطة طرق وضع العلامات النسب. الحاسمة الأكثر صعوبة هو أننا وجدنا في الحصول على أعلى مستوى خلال 3 – D القرار خلال photoconversion من هذه البروتينات. في ضوء ذلك ، وربما أفضل مزيج من القرار ، وسهولة الاستخدام لوضع العلامات النسب في الزرد يجعل من استخدام ديكستران فلوريسئين قفص ، صبغة الفلورسنت المنضم إلى مجموعة التبريد التي أقنعة 9 في مضان. يمكن أن تكون الصبغة ثم "uncaged" (صدر من مجموعة التبريد) داخل خلية معينة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية من مصباح الليزر أو الزئبق ، مما يسمح للتصور ، أو مضان مناعي. خلافا لأساليب iontophoretic ، يمكن حقنه في قفص فلوريسئين مع الأجهزة القياسية وحقن uncaged مع مجهرا epifluorescence مجهزة ذات الثقب 10. بالإضافة إلى ذلك ، كشف عن الأجسام المضادة ضد فلوريسئين فقط على شكل uncaged ، وكذلك تثبيت حاتمة ينجو 11. أخيرا ، يمكن تفعيلها فلوريسئين قفص مع القرار 3 – D عالية جدا ، خصوصا إذا كان يعمل المجهر ثنائي الفوتون 12،13. يصف هذا البروتوكول وسيلة لوضع العلامات النسب التي فلوريسئين قفص uncaging والليزر. Subsequenctly ، يتم الكشف عن uncaged فلوريسئين بالتزامن مع الحواتم أخرى مثل وضع العلامات التي GFP مع الأجسام المضادة.
Protocol
Discussion
كما هو موضح ، هذا البروتوكول يتيح وضع العلامات النسب سريع نسبيا في الزرد أن الأسلوب المبني على التقنيات المستخدمة عادة من microinjection ، المجهري ، والمناعي. لقد وجدنا أن ليزر uncaging أن يكون الوسيلة الأكثر فعالية وأقل تكلفة لuncage فلوريسئين بطريقة المترجمة. ويمكن استخدام هذه ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر دان كارلين للحصول على مساعدة في صنع فلوريسئين مطلقة السراح. بالإضافة نود أن نشكر مصادر التمويل التالية : مدرسة الطب بجامعة فاندربيلت البرنامج التنموي لعلم الأحياء المنح التدريبية لJAC ، والمعاهد الوطنية للصحة JTG HD054534to.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Riferimenti
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
