Lineage Labeling van de zebravis Cellen met Laser Uncagable Fluoresceïne Dextran
Summary
Dit protocol schetst een manier om de label en sporen het lot van kleine groepjes cellen zebravis embryo's met behulp van UV-uncaging van gekooide fluoresceïne, gevolgd door een hele berg immunokleuring om het signaal van de Uncaged fluoresceïne versterken.
Abstract
Een centraal probleem in de ontwikkelingsbiologie is af te leiden van de oorsprong van de talloze soorten cellen aanwezig zijn in gewervelde dieren als ze voortvloeien uit ongedifferentieerde precursoren. Onderzoekers hebben gebruikt verschillende methoden van afkomst etiketteren, zoals DII etikettering 1 en de druk injectie van herleidbaar enzymen 2 om na te gaan lot van de cel in latere stadia van de ontwikkeling in model systemen. Het eerste lot kaarten in zebravis (Danio rerio) werden samengesteld door iontoforetische injectie van fluorescerende kleurstoffen, zoals rhodamine dextran, in enkele cellen in discrete gebieden van het embryo en het opsporen van de gelabelde cel lot na verloop van tijd 3-5. Hoewel effectief, worden deze methoden technisch veeleisend en vereist gespecialiseerde apparatuur die niet vaak gevonden in de zebravis labs. Onlangs zijn photoconvertable fluorescerende eiwitten, zoals de Eos en Kaede, die onomkeerbaar van groen naar rood fluorescentie wanneer blootgesteld aan ultraviolet licht, het zien van het toenemend gebruik in zebravis 6-8. De optische helderheid van de zebravis embryo en het relatieve gemak van transgenese hebben deze bijzonder aantrekkelijke tools voor lineage etikettering en de migratie van cellen te observeren in vivo 7. Ondanks hun nut hebben deze eiwitten ten opzichte van een aantal nadelen met dye-gemedieerde lijn labeling methoden. Het belangrijkste is dat het moeilijk we hebben gevonden in het verkrijgen van een hoge resolutie 3-D tijdens de photoconversion van deze eiwitten. In dit licht, misschien wel de beste combinatie van resolutie en het gebruiksgemak voor de lijn de etikettering in de zebravis maakt gebruik van gekooide fluoresceïne dextran, een fluorescente kleurstof die is gebonden aan een quenching groep die maskers zijn fluorescentie 9. De kleurstof kan dan "Uncaged" (vrij uit de quenching-groep) worden binnen een specifieke cel met behulp van UV-licht van een laser of kwiklamp, waardoor visualisatie van de fluorescentie of immunodetectie. In tegenstelling tot de iontoforetische methoden, kan gekooide fluoresceïne worden geïnjecteerd met standaard injectie apparaten en Uncaged met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een pinhole 10. Daarnaast, antistoffen tegen fluoresceïne detecteren alleen de Uncaged vorm, en het epitoop overleeft fixatie goed 11. Ten slotte kan gekooide fluoresceïne worden geactiveerd met een zeer hoge resolutie 3-D, in het bijzonder als twee-foton microscopie is 12,13 gebruikt. Dit protocol beschrijft een methode van de lijn etikettering door gekooid fluoresceïne en laser uncaging. Subsequenctly, is Uncaged fluoresceïne tegelijk gedetecteerd met andere epitopen, zoals GFP door middel van etikettering met antilichamen.
Protocol
Discussion
Zoals beschreven, dit protocol voorziet in een relatief snelle lijn etikettering methode in zebravis, dat is gebouwd op de algemeen gebruikte technieken van micro-injectie, microscopie, en immunofluorescentie. Wij hebben geconstateerd dat laser uncaging naar de meest efficiënte en kosteneffectieve manier om fluoresceïne vrij maken in een gelokaliseerde mode te zijn. Deze methode kan worden gebruikt om lijn label met experimentele eindpunten zo laat 4 DPF. Echter, als cellen delen, de gekooide-fluoresceïne concentrati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Dan Carlin bedanken voor hun hulp bij het maken van kooien fluoresceïne. Daarnaast zouden we graag de volgende financieringsbronnen te bedanken: Vanderbilt University Medical School Programma voor Ontwikkelingsbiologie Training Grant aan JAC en NIH HD054534to JTG.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Riferimenti
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
