Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran
Summary
Dieses Protokoll zeichnet ein Weg, um Etiketten und Spurenelemente das Schicksal der kleinen Gruppen von Zellen Zebrafischembryonen mit UV-Uncaging der Käfig Fluorescein, durch whole mount Immunomarkierung, um das Signal aus dem uncaged Fluoreszein verstärken gefolgt.
Abstract
Ein zentrales Problem in der Entwicklungsbiologie ist es, den Ursprung der unzähligen Zelltypen, die in Wirbeltieren wie sie sich aus undifferenzierten Vorstufen entstehen abzuleiten. Die Forscher haben verschiedene Methoden der Linie Kennzeichnung, wie DiI Markierung 1 und Druck Injektion nachvollziehbar Enzyme 2 bis festzustellen Zellschicksal in späteren Stadien der Entwicklung in Modellsystemen eingesetzt. Die ersten Schicksal Karten im Zebrafisch (Danio rerio) wurden von iontophoretischen Injektion von Fluoreszenzfarbstoffen, wie Rhodamin Dextran montiert, in einzelne Zellen in diskreten Regionen des Embryos und Tracing der markierten Zelle das Schicksal im Laufe der Zeit 3-5. Während wirksam sind diese Methoden technisch anspruchsvoll und erfordern eine spezielle Ausrüstung nicht allgemein in Zebrafisch-Forschungsgruppen gefunden. In jüngster Zeit sind photoconvertable fluoreszierende Proteine, wie Eos und Kaede, die irreversibel von grünen Schalter auf rote Fluoreszenz bei UV-Licht ausgesetzt, sehen verstärkten Einsatz im Zebrafisch 6-8. Die optische Klarheit der Zebrafisch-Embryos und die relative Leichtigkeit der Transgenese haben diese besonders attraktiv Werkzeuge für die Linie Etikettierung gemacht und die Migration von Zellen in vivo 7 zu beobachten. Trotz ihrer Nützlichkeit, haben diese Proteine auch einige Nachteile auf Farbstoff-vermittelte Linie Kennzeichnung Methoden verglichen. Der wichtigste ist die Schwierigkeit, die wir bei der Beschaffung von hoher 3-D-Auflösung während Photokonversion dieser Proteine gefunden haben. In diesem Licht, vielleicht die beste Kombination aus Auflösung und Benutzerfreundlichkeit für Linie Kennzeichnung im Zebrafisch nutzt Käfig Fluorescein Dextran, einem Fluoreszenzfarbstoff, die zu einer Löschung Gruppe gebunden ist, dass Masken seine Fluoreszenz 9. Der Farbstoff kann dann "uncaged" (veröffentlicht von der Löschung Gruppe) innerhalb einer bestimmten Zelle mit UV-Licht von einem Laser-oder Quecksilber-Lampe, so dass Visualisierung der Fluoreszenz-oder Immundetektion. Im Gegensatz zu iontophoretischen Methoden können caged Fluorescein mit Standard-Einspritzvorrichtungen injiziert werden und uncaged mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einer Lochkamera 10 ausgestattet. Darüber hinaus erkennen Antikörper gegen Fluorescein nur die uncaged Form, und das Epitop überlebt Fixierung gut 11. Schließlich kann im Käfig Fluorescein mit einer sehr hohen 3-D-Auflösung aktiviert werden, besonders dann, wenn der Zwei-Photonen-Mikroskopie 12,13 eingesetzt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode der Linie Kennzeichnung von caged Fluorescein und Laser Uncaging. Subsequenctly ist uncaged Fluorescein gleichzeitig mit anderen Epitope wie GFP durch Markierung mit Antikörpern nachgewiesen.
Protocol
Discussion
Wie beschrieben, stellt dieses Protokoll eine relativ schnelle Linie Kennzeichnung Methode in Zebrafisch, dass bei den üblicherweise verwendeten Techniken der Mikroinjektion, Mikroskopie und Immunfluoreszenz gebaut wird. Wir haben festgestellt, dass Laser auf die effizienteste und kostengünstigste Weg, um Fluorescein in einer lokalisierten Mode Uncage werden Uncaging. Diese Methode könnte auf Linie Etikett mit experimentellen Endpunkte werden so spät wie 4 dpf verwendet. Doch wie sich Zellen teilen, die caged-Fluore…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Dan Carlin für Hilfe bei der Herstellung Käfig Fluorescein. Darüber hinaus möchten wir die folgenden Finanzierungsquellen danken: Vanderbilt University Medical School Program für Entwicklungsbiologie Training Grant zu JAC und NIH HD054534to JTG.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | ||
| Aminodextran, 10kDa | Invitrogen | D1860 | ||
| Zeba desalt spin columns | Pierce | 89889 | ||
| goat anti-fluorescein antibody | Invitrogen | A11095 | ||
| Alexa Fluor 633 Donkey anti-goat antibody | Invitrogen | A21082 | ||
| 35mmx10mm petri dishes | Becton-Dickinson | 351008 | ||
| Upright compound microscope with 40x water immersion objective | Leica | DM6000B | ||
| MicroPoint Manual Laser Illumination System | Photonic Instruments | |||
| Phenylthiourea (PTU) | Alfa Aesar | L06690 | ||
| Tricaine | Sigma | E10521 | ||
| Proteinase K | Roche | 03115836991 | ||
| Plastic thread | Any sewing supply store | |||
| Agarose | Research Products International | A20090 | ||
| SpeedVac | Thermo Scientific | Savant SPD131DDA | ||
| Vortexing mixer | VWR | Vortex Genie 2 | ||
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 |
Riferimenti
- Hatada, Y., Stern, C. D. A fate map of the epiblast of the early chick embryo. Development. 120, 2879-2889 (1994).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122, 300-319 (1987).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina. Science. 239, 1142-1145 (1988).
- Wetts, R., Fraser, S. E. Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages. Development. , 1-8 (1991).
- Woo, K., Fraser, S. E. Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system. Development. 121, 2595-2609 (1995).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).
- Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis. 44, 136-142 (2006).
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).
- Haugland, R. P. . Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. , 707-711 (2002).
- Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein. Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).
- Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo. Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).
- Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. High resolution fate map of the zebrafish diencephalon. Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).
- Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry. Dev Biol. 175, 177-183 (1996).
