Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

Summary

Dit artikel beschrijft een eenvoudige techniek om allogeen-specifieke anergie induceren in humane perifere bloed mononucleaire cellen. De techniek kan klinisch worden toegepast op niet-alloreactieve donorcellen te genereren. Infusie van deze cellen zou kunnen verbeteren immuun reconstitutie en vermindering van toxiciteit na allogene hematopoietische stamceltransplantatie.

Abstract

Allogene hematopoietische stamceltransplantatie (AHSCT) biedt de beste kans op genezing voor veel patiënten met aangeboren en verworven hematologische ziekten. Helaas kan transplantatie van alloreactieve donor T-cellen die een erkenning en schade gezonde patiënt weefsels resulteren in Graft-versus-Host Disease (GvHD) ^1. Een uitdaging om succesvol te AHSCT is het voorkomen van GvHD zonder bijbehorende aantasting van de gunstige effecten van donor T-cellen, in het bijzonder immuun reconstitutie en het voorkomen van terugval. GvHD kan voorkomen worden door niet-specifieke depletie van donor T-cellen van de stamcel transplantaten of door de toediening van farmacologische immunosuppressie. Helaas zijn deze benaderingen te verhogen besmetting en ziekte terugval ^2-4. Een alternatieve strategie is om selectief afbrekende alloreactieve donor T-cellen na allostimulation door de ontvanger antigeen presenterende cellen (APC) voor transplantatie. Vroege klinische trials van deze allodepletion strategieën verbeterde immuun herstel na HLA-mismatch HSCT zonder overdrijving GvHD ^{5, 6.} Echter, sommige allodepletion technieken vereisen speciale ontvanger APC productie ^{6, 7} en sommige benaderingen kunnen off-target effecten waaronder uitputting van de donor pathogeen-specifieke T-cellen ⁸ en CD4 T-cellen regelgeving ^9. Een alternatieve benadering is de inactivatie van alloreactieve donor T-cellen via inductie van allogeen-specifieke hyporesponsieve. Dit wordt bereikt door het stimuleren van donor cellen met de ontvanger APC terwijl blokkade van CD28-gemedieerde co-stimulatie signalen ^10. Deze "alloanergization" aanpak vermindert alloreactiviteit met 1-2 logs met behoud van pathogeen-en tumor-geassocieerde antigen T-cel responsen in vitro ¹¹ . De strategie is met succes toegepast in 2 afgerond en een lopende klinische pilot-studies waarin alloanergized donor T-cellen werden toegediend tijdens of na het HLA-mismatch HSCT resulteert in snelle immuun reconstitutie weinig infecties en minder ernstige acute en chronische GvHD dan historische controlegroep ontvangers van ongemanipuleerde HLA-mismatch transplantatie ^12. Hier beschrijven we onze huidige protocol voor het genereren van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) die zijn alloanergized aan HLA-mismatch niets stimulator PBMC. Alloanergization wordt bereikt door allostimulation in de aanwezigheid van monoklonale antilichamen tegen de liganden B7.1 en B7.1 tot CD28-gemedieerde costimulatie blokkeren. Deze techniek is niet vereist dat de productie van gespecialiseerde stimulator APC en is eenvoudig uit te voeren, waarvoor slechts een enkele en relatief korte ex vivo incubatie stap. Als zodanig kan de aanpak gemakkelijk gestandaardiseerd voor klinisch gebruik om donor T-cellen met een verminderde alloreactiviteit maar met behoud van pathogeen-specifieke immuniteit voor adoptieve overdracht in de setting van AHSCT om immuun reconstitutie te verbeteren zonder al te veel GvHD te genereren.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Voorbereiding van de PBMC</p><ol><li> Procedures voor een goede aseptische techniek en de universele voorzorgsmaatregelen moeten worden nageleefd tijdens de uitvoering van dit protocol.</li><li> Isoleer PBMC van gezonde vrijwillige donoren door de dichtheid gradiënt centrifugatie met behulp van Ficoll-Hypaque. Als alternatief gecryopreserveerde PBMC kan worden gereanimeerd.</li><li> Count levensvatbaar PBMC na kleuring met trypan Blue met behulp van een hemocytometer. Resuspendeer PBMC in complete cultuur media (CM) bij een concentratie van 1 miljoen levensvatbare cellen / ml in een 15 ml Falcon buis.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Instellen van de Bulk Alloanergizing Co-cultuur</p><ol><li> PBMC's van twee verschillende donoren zijn nodig om het opzetten van de alloanergization culturen. Cellen van een donor zal dienen als de responder en cellen van een andere donor zal fungeren als de stimulator (aangeduid als de eerste partij stimulator).</li><li> Plaats 10 miljoen stimulator PBMC op 1 miljoen / ml in een 15 ml Falcon buis en voeg 100 mg van anti-B7.1 en 100mg van anti B7.2 antilichamen tegen costimulatie blokkeren. Schud voorzichtig de buis en incubeer gedurende 30 minuten. Incubatie voorwaarden voor deze en alle volgende stappen zijn 37 ° C / 5% CO₂ / 80% luchtvochtigheid</li><li> Bestralen stimulator PBMC (3,3 Gy) en toevoegen aan een T-25 50cm³ Celkweek kolf met een gas-permeabel cap. Etiket de kolf "Bulk alloanergizing co-cultuur".</li><li> Voeg 10 ml van de reagerende PBMC (bij 1 miljoen / ml in CM) in de kolf.</li><li> Voeg een verdere 100mg elk van de anti-B7.1 en B7.2 anti-antilichamen en vóór meng aan het plaatsen van de kolf rechtop in een incubator voor 72 uur</li></ol><p class="jove_title"> 3. Instellen van de Bulk Controle Co-cultuur</p><ol><li> Plaats 10 miljoen stimulator PBMC (bij 1 miljoen / ml) in een 15 ml Falcon buis.</li><li> Bestralen 10 miljoen stimulator PBMC (3,3 Gy). En toevoegen aan een 50cm³ Celcultuur fles. Label "Bulk controle co-cultuur".</li><li> Voeg 10 ml van de reagerende PBMC op 1 miljoen / ml in CM aan de kolf en voorafgaand meng aan het plaatsen van de kolf rechtop in een incubator voor 72 uur.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Instellen van de primaire gemengde lymfocyt Reactie (MLR) naar de werkzaamheid van co-stimulerende blokkade Measure</p><ol><li> De werkzaamheid van costimulatoire blokkade wordt gemeten in een primaire MLR die is opgezet met behulp van PBMC van de bulk alloanergizing en controle co-culturen</li><li> De primaire MLR is ingesteld op dezelfde dag dat de bulk culturen zijn ingesteld</li><li> Eerste label een U-bodem 96 wells-plaat "Primaire MLR" voor elk van de drie tijdstippen te meten (Dag 4, 5 en 6 na de borden zijn ingesteld).</li><li> Schenk 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen in 15 ml Falcon buizen.</li><li> Pipetteer 200 ml celsuspensie van elke Falcon pijp in drievoud putjes op elk bord. Label deze putten "no costimulatoire blokkade (CSB)" voor de cellen uit de totale controle co-culturen en "CSB" voor de cellen van de bulk alloanergizing co-culturen</li><li> Voeg 200 ml CM tot 6 putten op elke plaat als negatieve controles. 200mL PBS wordt toegevoegd aan alle lege putten om de verdamping te verminderen. Plaats platen in de incubator.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Instellen van de secundaire MLR om de werkzaamheid van Alloanergization Measure</p><ol><li> 72 uur na het opzetten van de bulk co-culturen, zijn resterende alloresponses in alloanergized PBMC's gemeten in een secundaire MLR. In de secundaire MLR, PBMC van zowel de bulk alloanergizing co-cultuur en de bulk controle co-cultuur worden gewassen en opnieuw gestimuleerd met bestraalde PBMC allostimulator</li><li> Voor het instellen van de secundaire MLR label een U-bodem 96 wells-plaat "Secundaire MLR" voor elk van de drie tijdstippen te meten (Dag 3, 5 en 7 na instellen).</li><li> Verwijder 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen, transfer naar 15 ml Falcon buizen en centrifugeer gedurende 5-10 minuten op 2000 zorgvuldig rpm.Aspirate het supernatans, verstoren de korrel, voeg 10 ml van CM en weer centrifuge de cellen. Herhaal deze wasstap.</li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml van de CM. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan Blue kleuring, en pas de cel concentratie tot 1 miljoen levensvatbare responder cellen / ml.</li><li> Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon buis in drievoud putten van elk bord. Label deze putten "First Party (FP) allorestimulation"</li><li> Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon buis in een verdere drie putten op elk bord en label deze bronnen "CD3/28 stimulatie"</li><li> Om stimulator cellen voor te bereiden op de secundaire MLR, isoleren PBMC van vers bloed (of reanimeren gecryopreserveerd PBMC) van dezelfde gezonde donor gebruikt om de eerste partij stimulator PBMC's te leveren in de alloanergizing en controle culturen.</li><li> Hang PBMC van de FP donor bij een concentratie van 1 miljoen / ml en bestralen (3.3Gy)</li><li> Voeg 100 ml van bestraalde stimulator cellen om waterputten met het label "FP allorestimulation"</li><li> Voor de positieve controles, voeg 1 ml van elk van CD3 en CD28 monoklonale antilichamen en 98mL van de CM te putten met het label "CD3/28 stimulatie". Voeg 200 ml CM tot 6 putten op elke plaat als een negatieve controle en 200 ml PBS putten te legen. Leg de platen in de incubator.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Het meten van de specificiteit van Alloanergization</p><ol><li> De specificiteit van alloanergization wordt bepaald door het vergelijken van de proliferatie van de reagerende cellen van de voltooide alloanergizing en controle co-culturen na stimulatie met bestraalde PBMC verkregen van een "derde partij" gezonde donor (bv. een andere donor naar de eerste partij) in een secundaire MLR.</li><li> Label drie platen met 96 putjes "Secundaire MLR Specificiteit" Dag 3, 5 en 7.</li><li> Verwijder 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen over te dragen aan 15 ml Falcon buizen en centrifugeer gedurende 5-10 minuten bij 2000 rpm. Zorgvuldig aspireren het supernatans, verstoren de korrel, voeg 10 ml van CM en weer centrifuge de cellen. Herhaal deze wasstap.</li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml van de CM. tellen met behulp van trypan Blue kleuring, en pas de cel concentratie tot 1 miljoen levensvatbare responder cellen / ml.</li><li> Om van derden stimulator cellen voor te bereiden op de secundaire MLR, isoleren PBMC van vers bloed (of reanimeren gecryopreserveerd PBMC) van een nieuwe gezonde donor. Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon buis in drievoud putten van elk bord. Label deze putten "TP allostimulation"</li><li> Hang PBMC van een TP donor op 1 miljoen / ml en bestralen (3,3 Gy)</li><li> Voeg 200 ml bestraald TP stimulator cellen te putten met het label "TP allostimulation"</li><li> De specificiteit van alloanergization kan ook worden bepaald door het vergelijken van de proliferatie van de reagerende cellen van de voltooide alloanergizing en controle co-culturen na stimulatie met een besmettelijke pathogeen, zoals CMV. Voor deze stap is het essentieel om responder PBMC gebruiken van donoren met eerder aangetoond proliferatieve reacties aan CMV lysaat.</li><li> Label drie platen met 96 putjes "Secundaire MLR CMV" Dag 3, 5 en 7.</li><li> Ter voorbereiding van de responder cellen voor de secundaire MLR om CMV reacties te meten, transfer 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen tot 15 ml buizen en wassen, tellen en bij 1 miljoen cellen / ml opnieuw in suspensie in CM zoals eerder beschreven . Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon pijp in een drie putten op elk bord.</li><li> Voeg 0,1 mL van CMV-lysaat in 100ul CM te putten</li><li> Voeg 200 ml van CM tot 6 putten op alle plaat als een negatieve controle en voeg 200 ml PBS putten te legen. Leg de platen in de incubator.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Het meten van proliferatie in de primaire en secundaire MWR</p><ol><li> Responder celproliferatie wordt gemeten door thymidine assay in de primaire en secundaire MWR. Proliferatie wordt gemeten op dag 4, 5 en 6 na de primaire MLR platen opgezet en op dag 3, 5 en 7 na de secundaire MLR platen opgezet.</li><li> 1mCi van getritieerd thymidine wordt toegevoegd aan de wells 16 uur vóór het oogsten</li><li> Na de toevoeging van getritieerd thymidine, is de plaat geïncubeerd gedurende een uur further16 vervolgens geoogst op een filter mat met behulp van een Tomtec harvester (of iets dergelijks). De lucht drogen van de filtermat een uur plaats dan in een monster zak, voeg 5 ml scintillatievloeistof en afdichting. Lees de plaat in een Wallac Micro beta scintillatieteller of iets dergelijks.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Het berekenen van de werkzaamheid van co-stimulerende blokkade in de primaire MLR</p><ol><li> Het percentage inhibitie (PI) van de primaire alloresponses wordt berekend als 100 x [gemiddelde cpm in allostimulation putten (bulk alloanergy co-cultuur PBMC) – gemiddelde cpm in allostimulation putten (bulk controle co-cultuur PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. Het berekenen van de werkzaamheid van Alloanergization in de secundaire MLR</p><p class="jove_content"> De PI van het voortgezet alloresponses wordt berekend als<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. De berekening van de specificiteit van Alloanergization in de secundaire MLR</p><ol><li> Na restimulatie van cellen met CD3 en CD28, kan TP allostimulators of CMV-antigeen, de PI van de antwoorden op deze stimuli ook worden berekend met behulp van deze formule. Dit geeft een maat voor de specificiteit van de alloanergization proces</li></ol><p class="jove_title"> 11. Het genereren van Alloanergized Donor PBMC voor klinisch gebruik na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT)</p><ol><li> Alloanergized donor PBMC kan worden gegenereerd voor klinisch gebruik na HLA-mismatch allogene HSCT gebruik van het protocol hierboven geschetste</li><li> Bij het genereren van cellen voor klinisch gebruik, responder PBMC worden verkregen uit de HSCT donor en stimulator PBMC van de HSCT ontvanger voorafgaand aan de transplantatie.</li><li> Bij het genereren van PBMC voor klinisch gebruik, alle stappen worden uitgevoerd onder Good Manufacturing Process voorwaarden in geaccrediteerde stamcellen verwerkingsinstallaties.</li><li> Extra kwaliteitscontrole testen worden uitgevoerd met inbegrip van endotoxine testen en Gramkleuring en cultuur om de veiligheid te voldoen voorafgaand aan de release van de cellen voor klinisch gebruik</li></ol><p class="jove_title"> 12. Representatieve resultaten</p><p class="jove_content"> Met behulp van HLA-mismatch stimulator en responder PBMC, de aanwezigheid van costimulatoire blokkade in de primaire MLR vermindert betekenen alloproliferation van de reagerende PBMC op dag 5 tot ongeveer 30% (+ / – 10%, gemiddelde + / – standaard deviatie) van die gezien in controle primaire MLR in de afwezigheid van costimulatoire blokkade. Dit komt overeen met een gemiddelde remming van primaire alloproliferation van rond de 70% (+ / – 10%) bij D5,<strong> Figuur 1 A en B</strong>.</p><p class="jove_content"> In de secundaire MLR op dag 5, FP alloproliferation van alloanergized PBMC is gewoonlijk 10-15% (+ / – 10%) van dat van controle PBMC gelijk aan een gemiddelde remming van de proliferatie van 85-90% (+ / – 10 %),<strong> Figuur 2A en B</strong>. Dit toont aan dat alloanergized PBMC zijn hyporesponsieve tot FP allostimulators.</p><p class="jove_content"> In tegenstelling alloanergized PBMC meestal behouden 70-100% van hun verspreiding te mitogenen (CD3/CD28 antistoffen), TP allostimulators en CMV lysaat (in CMV-reactief donoren). Dit toont aan dat hyporesponsieve van alloanergized PBMC is specifiek voor FP allo-antigenen.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figuur 1. A.</strong> Proliferatie (bepaald door thymidine) in een primaire gemengde lymfocyt reactie met behulp van HLA-mismatch stimulator en responder perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in de afwezigheid of de aanwezigheid van costimulatoire blokkade met behulp van gehumaniseerd monoklonaal anti-B7.1 en B7.2- antilichamen. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor 8 representatieve experimenten met behulp van een unieke stimulator-responder paren.<strong> B</strong>. Percentage remming van alloproliferation in het primair MWR uitgevoerd in de aanwezigheid van costimulatoire blokkade met behulp van gehumaniseerd monoklonaal anti-B7.1 en B7.2-antilichamen. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor dezelfde acht unieke stimulator-responder paren afgebeeld in figuur 1A.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figuur 2. A.</strong> Proliferatie (bepaald door thymidine) in het voortgezet MWR waar responder PBMC van primaire MWR uitgevoerd in de afwezigheid (controle PBMC) of de aanwezigheid van costimulatoire blokkade (alloanergized PBMC) zijn opnieuw gestimuleerd met bestraalde eerste partij stimulators. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor de 8 unieke stimulator-responder paren afgebeeld in figuur 1.<strong> B</strong>. Percentage remming van de First Party alloproliferation in het voortgezet MWR waar responder PBMC van primaire MWR uitgevoerd in de afwezigheid (controle PBMC) of de aanwezigheid van costimulatoire blokkade (alloanergized PBMC) zijn opnieuw gestimuleerd met bestraalde eerste partij stimulators. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor de 8 unieke stimulator-responder paren afgebeeld in figuur 1 en figuur 2A.</p>

Discussion

<p class="jove_content"> De inductie van allogeen-specifieke hyporesponsieve, of anergie, bij de donor PBMC via allostimulation in de aanwezigheid van co-stimulerende blokkade is een eenvoudige techniek voor het genereren van donor PBMC met verminderde alloreactiviteit. We hebben het proces in het laboratorium en zijn op dit moment de toepassing van de strategie in de kliniek om donor PBMC te genereren met een verminderde alloreactiviteit voor infusie na HLA-mismatch allogene HSCT. Het doel van het gebruik van deze therapie is om immuun reconstitutie te verbeteren zonder teveel toxiciteit. Hoewel onze huidige klinische toepassing van de strategie is beperkt tot de instelling van allogene HSCT, kan de aanpak worden toegepast op andere instellingen waar weefsel schade is veroorzaakt door ongewenste T-cel responsen, zoals de afwijzing van vaste orgaantransplantatie of auto-immune voorwaarden.</p><p class="jove_content"> Enkele reagentia kunnen worden gebruikt voor blokkade van CD28-gemedieerde co-stimulerende signalen tijdens de alloanergization co-cultuur proces. Hier beschrijven we onze huidige protocol met behulp van klinisch-grade gehumaniseerde muriene monoklonale antilichamen gericht tegen de liganden van CD28 (B7.1 en B7.2). Niet-klinische kwaliteit muriene anti-humaan B7.1 en B7.2 antilichamen zijn verkrijgbaar bij verschillende fabrikanten. Als alternatief kan het fusie-eiwit cytotoxische T lymfocyten antigeen (CTLA) 4-immunoglobuline (Ig) worden gebruikt om de CD28-costimulatie blok tijdens de alloanergization proces. CTLA4-Ig, dat bestaat uit het extracellulaire gedeelte van de CTLA4 molecuul gekoppeld aan het IgG Fc gamma receptor, bindt met hoge affiniteit aan B7.1 en B7.2. Het gebruik van CTLA4-Ig resulteert in een vergelijkbare werkzaamheid en de specificiteit van alloanergization van de menselijke PBMC.</p><p class="jove_content"> De techniek van alloanergization is eenvoudig uit te voeren. Vers of eerder gecryopreserveerd stimulator PBMCs kan worden gebruikt met geen significante verschillen in de uitkomst van het proces. De eis voor slechts een relatief korte ex vivo incubatie stap met geen celsortering procedures voor zo min mogelijk celdood en bacteriële besmetting van cellen voorafgaand aan de infusie, waardoor de strategie relatief eenvoudig toe te passen in een klinische schaal.</p><p class="jove_content"> Een beperking van de aanpak beschrijven we (en andere benaderingen om selectief te verminderen alloreactiviteit van menselijke cellen) is de afwezigheid van een real-time analyse om de resterende alloreactiviteit te bepalen. Proliferatie assays nemen 3-5 dagen uit te voeren aan de vermindering van alloreactiviteit en cellen gegenereerd voor klinisch gebruik te bevestigen moet worden toegediend voorafgaand aan de resultaten van deze testen beschikbaar zijn. Bovendien is het meten van de proliferatie van PBMC's van thymidine, maar gemakkelijk uit te voeren maatregelen proliferatie van B-cellen en andere cellen subsets in aanvulling op T-cel proliferatie. CFSE kleurstof verdunning van responder PBMC's kan worden gebruikt als een alternatieve test en maakt de bepaling van de T-cel subset-specifieke alloproliferation. Een manier om de klinische toepassing van onze strategie aanpak te verbeteren zou zijn om te ontwikkelen en te valideren een test van alloreactiviteit die slechts een paar uur uit te voeren die vóór zouden kunnen worden uitgevoerd aan de release van alloanergized cellen voor klinisch gebruik neemt.</p><p class="jove_content"> In aanvulling op het aantonen van de efficiacy van de strategie is het ook belangrijk om te bevestigen de specificiteit alloanergization proces. Dit kan eenvoudig worden gedaan door de bepaling van de relatieve behoud van alloresponses die specifiek zijn voor derden allostimulators en wanneer CMV-reactieve donor cellen worden alloanergized, door het behoud van de proliferatieve reacties aan CMV</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ficoll-Hypaque PLUS	GE Life Sciences	17-1440-02
RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
Hepes 1M	Invitrogen	15630-080
L-Glutamine 200mM	Invitrogen	25030-081
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Human AB serum (heat inactivated)	Gemini Bio-Products	100-512	Use validated batches
Complete Culture Media (500ml)			440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin
Irradiator	GammaCell 1000
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps	Corning, Inc.	3056
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies			See protocol text
U bottomed 96 well culture plates	BD Labware	353077
Monoclonal CD3 antibody	Beckman Coulter	IM0178	Reconstitute with 200ml distilled water
Monoclonal CD28 antibody	Beckman Coulter	IM1376	Reconstitute with 200ml distilled water
CMV grade 2 antigen	Microbix	EL-01-02
Tritiated Thymidine	NEN	NET027
Scintillation Fluid	PerkinElmer, Inc.	1205-440
Harvester	Tomtec
Printed Filtermat A	PerkinElmer, Inc.	1450-421
Filter Bag	PerkinElmer, Inc.	1450-432
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter	Wallac